[發明專利]一種表達Streptomyces sp.FA1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌

有效

• 申請號: 201710455799.7
• 申請日: 2017-06-16
• 公開（公告）號: CN107236680B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 吳敬;吳丹;潘陽
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/24;C12N15/81;A23K10/18;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種表達Streptomyces sp.FA1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，屬于基因工程領域。本發明以質粒pMD18?T?XynA為模板、設計引物、PCR擴增獲得目的基因，所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。本發明還公開了一種重組畢氏酵母工程菌的生產方法，包括如下步驟：(1)利用全基因合成技術合成自主復制序列PARS；(2)構建表達載體pGAPZαA?PARS；(3)構建重組表達載體pGAPZαA?PARS?XynA；(4)畢氏酵母宿主的轉化及陽性轉化子篩選；(5)搖瓶誘導培養；(6)重組畢氏酵母工程菌發酵罐水平誘導生產木聚糖酶。

技術領域

本發明涉及一種表達Streptomyces sp.FA1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，屬于基因工程領域。

背景技術

木聚糖酶屬于糖苷水解酶[EC 3.2.1.x]，能應用在多個領域中。木聚糖酶和其他半纖維素酶一起添加在飼料中利于增加飼料營養分解；在制漿和造紙工業領域，木聚糖酶可作為預漂白劑處理紙漿，從而降低紙漿漂白過程中化學試劑使用量，減少對環境的污染；在食品領域可以用于面制品烘焙，能夠改善面制品的品質；木聚糖酶還用于制備低聚木糖。麻類植物的纖維素含量豐富，是紡織行業中纖維原材料，但是麻類植物中含有半纖維素、木質素、果膠等雜質不利于紡織，木聚糖酶可以進行脫膠以去除這些膠質，因而在紡織工業中木聚糖酶也有相當的應用，可減少化學品對環境的污染。迄今為止，國內外已報道了400多種木聚糖酶基因，大多數木聚糖酶在野生菌中表達量僅在10-20IU·mL^-1。為了進一步推動木聚糖酶在工業生產中的應用，利用分子生物學方法將木聚糖酶基因進行異源表達以提高木聚糖酶的表達水平，是目前普遍采用的木聚糖酶制備方式。

畢氏酵母表達系統主要包括誘導型表達系統和組成型表達系統。誘導型表達系統中使用乙醇氧化酶為啟動子(pAOX1)來誘導表達外源蛋白，期間需要進行初始碳源和甲醇之間的轉換，導致存在發酵周期長、操作不方便、需要掌握好碳源的轉換時間、甲醇含量難以監測的缺點；此外甲醇屬于易揮發、易燃易爆物質，具有一定的生產危險性，不方便大量儲存；甲醇還屬于劇毒物質，不適用于食品方面的應用，因而制約了pAOX1表達載體在食品領域的大規模應用。組成型表達系統是最近幾年廣泛使用的畢氏酵母表達系統，其中三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(pGAP)是較為常用的同生長相偶聯的組成型表達系統啟動子，可以利用甘油或者葡萄糖等碳源生長并高效表達外源基因，具有不需要更換碳源、操作便捷的優點。尤其是該啟動子利用無毒害性碳源，使pGAP質粒構建的組成型表達系統對于表達食品行業用酶制劑具有更重要意義。

外源基因可以整合進宿主基因組進行表達，也能以游離質粒的形式進行表達。整合型表達具有遺傳穩定的優點，而游離型表達具有拷貝數高的優點。目前在畢氏酵母表達系統中，木聚糖酶基因均是構建整合型重組菌株進行外源基因重組表達，尚未見到采用游離型表達質粒來進行表達。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種穩定的、可以大量分泌木聚糖酶的游離表達型畢氏酵母重組菌及其構建方法，工業應用前景廣闊。

本發明的第一個目的是提供一種表達木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，所述畢氏酵母重組菌是將Streptomyces sp.FA1來源的木聚糖酶基因，連接到含有自主復制序列的游離表達質粒上，轉化至畢氏酵母中得到的畢氏酵母重組菌。

在本發明的一種實施方式中，所述木聚糖酶基因氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述自主復制序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本發明的一種實施方式中，所述游離表達載體為通過將核苷酸序列如SEQ IDNO:2的PARS復制子連接到pGAPZαA質粒上得到pGAPZαA-PARS游離表達載體。

在本發明的一種實施方式中，所述畢氏酵母為畢氏酵母KM71、GS115或SMD168。