[發(fā)明專利]一種表達(dá)Streptomyces sp.FA1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710455799.7
• 申請(qǐng)日: 2017-06-16
• 公開（公告）號(hào): CN107236680B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳敬;吳丹;潘陽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N9/24;C12N15/81;A23K10/18;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1. 一種表達(dá)木聚糖酶畢氏酵母重組菌，其特征在于，所述畢氏酵母重組菌是將鏈霉菌（Streptomyces sp.）FA1來源的木聚糖酶基因，連接到含有自主復(fù)制序列的游離表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至畢氏酵母（Pichia pastoris）中得到的畢氏酵母重組菌；所述木聚糖酶基因氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述游離表達(dá)載體為通過將核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的PARS復(fù)制子連接到pGAPZαA質(zhì)粒上得到的pGAPZαA-PARS游離表達(dá)載體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述畢氏酵母重組菌，其特征在于，所述畢氏酵母為畢氏酵母KM71、GS115或SMD168。

3.一種權(quán)利要求1所述畢氏酵母重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

（1）獲得氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的木聚糖酶基因；

（2）獲得序列如SEQ ID NO:2所示的自主復(fù)制子PARS基因；

（3）將步驟（2）所得PARS基因與質(zhì)粒pGAPZαA相連，得到表達(dá)載體pGAPZαA-PARS；

（4）將步驟（1）中的木聚糖酶基因與步驟（3）中的表達(dá)載體 pGAPZαA-PARS相連，得到重組載體 pGAPZαA-PARS-XynA；

（5）將重組載體 pGAPZαA-PARS-XynA轉(zhuǎn)化到畢氏酵母中，得到所述畢氏酵母重組菌。

4.權(quán)利要求1所述的畢氏酵母重組菌生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）以權(quán)利要求1所述畢氏酵母重組菌為生產(chǎn)菌株，活化后，30^oC、200rpm條件下培養(yǎng)24h，得一級(jí)種子發(fā)酵液；

（2）以2.5%接種量接種一級(jí)種子發(fā)酵液至種子培養(yǎng)基中，30^oC、200rpm條件下培養(yǎng)24 h，得二級(jí)種子發(fā)酵液；

（3）以10%的接種量將二級(jí)種子發(fā)酵液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中30^oC、200rpm進(jìn)行發(fā)酵；

（4）待DO值迅速上升時(shí)，進(jìn)行補(bǔ)料，OD600=100時(shí)停止補(bǔ)料，饑餓至第二次出現(xiàn)DO值迅速上升時(shí)繼續(xù)補(bǔ)料。

5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為BSM培養(yǎng)基；其中BSM 培養(yǎng)基包括如下成分 ：85%磷酸26.7 mL/L，CaSO₄ 0.93 g/L，K₂SO₄ 18.2 g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9 g/L，KOH 4.13 g/L，甘油 40.0 g/L，PTM₁ 4.35 mL/L，上述成分均溶于水中形成所述BSM 培養(yǎng)基。

6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述方法中補(bǔ)料配方為50%甘油、1.25%PTM₁；甘油和 PTM₁ 溶于水中形成所述補(bǔ)料。

7.權(quán)利要求1所述畢氏酵母重組菌在飼料、食品、紡織或化工領(lǐng)域的應(yīng)用。