[發明專利]一種利用腺苷代替ATP進行酶促反應的生產方法

有效

• 申請號: 201710453365.3
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN109136309B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 劉珊珊;劉輝;周穩文;秦永發
• 申請（專利權）人: 北京天開易達生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/32
• 分類號: C12P19/32;C12P13/12;C12P19/02;C12P17/10;C12P13/04;C12N9/00;C12N15/70
• 代理公司: 北京中珒知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11806
• 代理人: 王中

本發明公開了一種利用腺苷代替ATP進行酶促反應生產的方法及其應用，該方法包括以下步驟：(1)在酶促反應體系中，按比例添加ATP再生酶、AK酶以及腺苷進行酶促反應；(2)固定化的ATP再生酶和AK酶在反應罐中直接分離，游離的ATP再生酶和AK酶通過過濾器中超濾膜分離；(3)將步驟(2)濾出液進行分離、純化，獲得產物。本發明具有如下有益效果：1)使用腺苷替代ATP或AMP，為工業生產節約了大量成本；2)建立了穩定的酶回收體系，節能環保；3)少量生成的副產物ATP、ADP及AMP或直接用于循環反應，或用于生產ATP，或集中通過過濾、離子交換等方法進行純化，操作簡單。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種利用腺苷代替ATP進行酶促反應的生產方法。

背景技術

三磷酸腺苷(ATP)由一個腺苷和三個磷酸基團組成，分子量為507，分子式C₁₀H₁₆N₅O₁₃P₃。它是生物能量的轉換器和貯存器，在利用和轉換能量的酶促反應中，起著不可替代的重要作用。

由于目前ATP成本偏高，在工業生產中直接使用ATP進行酶促反應收益甚微。因此，能夠在反應生產中投入少量的ATP，通過建立穩定、有效的ATP再生體系，使ATP在反應過程中循環利用是目前利用ATP進行工業化生產的研究方向。

工業上ATP再生常用的方法是利用酵母菌的糖酵解途徑，進行底物水平磷酸化方式再生ATP。此法參與催化反應的酶眾多，反應過程復雜，反應過程不易控制，產品批次間質量差異較大。同時酵母酶系質量常因供應的廠家不同、批次不同、甚至季節不同而有很大差異。另外反應過程需要加入大量的酵母細胞酶液，引入了許多蛋白、色素等雜質給后期純化帶來一定困難。近年來，ATP再生的研究重點轉向使用單一酶或較簡單的酶系，獲得高效穩定的再生效果。其中，乙酸激酶、氨激酶、丙酮酸激酶等酶均可有效再生ATP。但是，這些酶所利用的底物價值昂貴，如丙酮酸激酶所利用的磷酸烯醇式丙酮酸；且生成的副產物有一定的生物毒性和污染性，如乙酸激酶、氨激酶催化反應的產物分別為乙酸和氨氣，因此較難在工業生產中大量使用。

專利CN201610268246.6利用多聚磷酸或其鹽作為磷酸和能量供體，使用多聚磷酸激酶(PPK，EC 2.7.4.1)、腺苷酸激酶(ADK，EC 2.7.4.3)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸轉移酶(PAP，EC 2.7.4.-，有文獻報道該酶也屬于PPK酶中的一類，但IUBMB對該酶分類尚不十分明確)三種“ATP再生酶”合理組合，再生ATP，并應用于多種需ATP的酶促反應。此方法反應底物價格相對低廉，產物污染較小，適用于工業化生產。但使用此方法仍需加入一定量的ATP進行酶促反應。

發明內容

本發明提供了一種利用腺苷代替ATP進行酶促反應的生產方法，該方法可進一步降低生產成本，即在原有含有ATP再生酶的反應體系中添加腺苷激酶(AK，EC 2.7.1.20)，該酶可催化腺苷生成AMP，組合上述其它ATP再生酶，可不使用ATP，僅添加少量腺苷即可進行酶促反應，是該領域一項重大革新。

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：

一種利用腺苷代替ATP進行酶促反應的生產方法，所述酶促反應為需要ATP的酶促反應，包括以下步驟：

(1)在酶促反應體系中，按比例添加ATP再生酶、AK酶以及腺苷進行酶促反應：

通過基因工程改造、發酵、純化獲得ATP再生酶和AK酶，或以自然提取等其它方式獲得ATP再生酶和AK酶。ATP再生酶和AK酶可以游離酶的形式制成酶液或者干粉；也可進一步固定于固定化載體上，制得固定化ATP再生酶和AK酶。