[發明專利]在畢赤酵母中高效表達重組豬表皮生長因子的方法

在審

• 申請號: 201710452655.6
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107365374A
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發明（設計）人: 李巨浪;伊芬娜;劉璨穎
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C07K14/485
• 分類號: C07K14/485;C12N15/12;C12N15/81
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司44100
• 代理人: 許英偉

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及在畢赤酵母中高效表達重組豬表皮生長因子的方法。

背景技術

表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)是許多哺乳動物中存在的一種由53個氨基酸組成的促細胞有絲分裂多肽。EGF能促進蛋白及DNA的合成、細胞的增殖和分化。臨床應用上，EGF對人和動物腸道健康有重要作用，有助于保護腸道屏障的完整性，有利于腸道發育，維持小腸上皮細胞穩態，促進仔豬胃腸上皮細胞的成熟，降低斷奶仔豬的應激，提高斷奶仔豬的免疫功能，是有效的腸道調節劑。此外，EGF能刺激靜止期豬卵母細胞的成熟，加速卵子的排出，提高母豬的繁殖率。因此，豬EGF在畜牧業發展中有重要的應用前景。

動物內源性EGF分泌量少不能滿足機體的需求，目前運用生物技術表達外源性EGF的工程菌有大腸桿菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、釀酒酵母和畢赤酵母。實際生產應用中，對于生產生物蛋白產品基因工程菌的要求為，遺傳背景清晰，遺傳性質穩定，易于基因操作，培養成本低，產量高，無毒副產品。畢赤酵母具有已經商業化，較為成熟的表達系統。但目前報道使用酵母表達EGF的濃度較低，僅為30mg/L(Wang et al.,2014)，因此，急需更為高效的酵母表達系統滿足大規模生產需求。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的不足，提供一種能夠在畢赤酵母中高效地表達重組豬表皮生長因子的方法。

為此，本發明提供了如下技術方案。

一種在畢赤酵母中高效表達重組豬表皮生長因子的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)構建重組豬EGF表達載體pJ912-pEGF：人工合成豬EGF核苷酸序列，在所述豬EGF核苷酸序列的5’端和3’端分別加入SmalI和PstI酶切位點，得到豬EGF合成產物，用SmalI和PstI雙酶切表達載體pJ912并進行回收，將回收后的表達載體pJ912與所述豬EGF合成產物用T4DNA連接酶連接以構建重組質粒pJ912-pEGF；

(2)用重組質粒pJ912-pEGF電轉化畢赤酵母X-33：將重組質粒pJ912-pEGF的DNA用SwaI酶切，線性化，用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法進行純化；純化后的線性質粒DNA溶解于10ul無核酸酶水中；再用純化后的線性質粒DNA電轉化畢赤酵母X-33；得到重組子。

(3)生物發酵表達豬EGF。

優選地，所述豬EGF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

優選地，所述表達載體pJ912含有SmalI和PstI酶切位點、AOX1啟動子、α因子分泌信號序列。

優選地，所述步驟(2)中，電轉化時使用的電比色皿寬0.4cm，電轉化的條件為：電壓1.5kv，電擊4ms。進一步，電擊過程在冰上進行。

優選地，所述步驟(2)還包括將所述重組子涂布于YPD瓊脂培養基平板上篩選。更優選地，所述YPD瓊脂培養基的成分為1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％瓊脂、1M山梨醇和100ug/ml博來霉素。

優選地，所述步驟(2)還包括用以下引物對所述重組子進行PCR擴增篩選，篩選出陽性重組子；所述引物序列如下：

上游引物:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，

下游引物：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

優選地，在小規模生物發酵表達豬EGF中，所述步驟(3)的生物發酵表達條件為：甘油培養溫度為30℃，甲醇誘導溫度為25℃，甲醇誘導體積濃度為1％，pH值為5.5。

優選地，在大規模生物發酵表達豬EGF中，所述步驟(3)的生物發酵表達條件為：甘油培養溫度為30℃，甲醇誘導溫度為26℃，甲醇體積濃度為2％，pH值為5.5。

與現有技術相比，本發明的方法能夠實現在畢赤酵母中更高效地表達重組豬表皮生長因子。

附圖說明

圖1為重組表達質粒pJ912-pEGF的構建圖。

圖2為PCR檢測陽性重組畢赤酵母的結果。

圖3為用蛋白質印跡法比較不同豬EGF拷貝數重組酵母中豬EGF表達量的結果。

圖4為用蛋白質印跡法檢測重組酵母菌株不同發酵時間豬EGF表達量的結果。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的技術方案進行說明，應當理解，此處描寫的實施例僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。

1、豬表皮生長因子EGF基因的獲得：