[發(fā)明專利]在畢赤酵母中高效表達(dá)重組豬表皮生長(zhǎng)因子的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710452655.6
• 申請(qǐng)日: 2017-06-15
• 公開（公告）號(hào): CN107365374A
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李巨浪;伊芬娜;劉璨穎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K14/485
• 分類號(hào): C07K14/485;C12N15/12;C12N15/81
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司44100
• 代理人: 許英偉

1.一種在畢赤酵母中高效表達(dá)重組豬表皮生長(zhǎng)因子的方法，其包括如下步驟：

(1)構(gòu)建重組豬EGF表達(dá)載體pJ912-pEGF：人工合成豬EGF核苷酸序列，在所述豬EGF核苷酸序列的5’端和3’端分別加入SmalI和PstI酶切位點(diǎn)，得到豬EGF合成產(chǎn)物，用SmalI和PstI雙酶切表達(dá)載體pJ912并進(jìn)行回收，將回收后的表達(dá)載體pJ912與所述豬EGF合成產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接以構(gòu)建重組質(zhì)粒pJ912-pEGF；

(2)用重組質(zhì)粒pJ912-pEGF電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33：將重組質(zhì)粒pJ912-pEGF的DNA用SwaI酶切，線性化，用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法進(jìn)行純化；純化后的線性質(zhì)粒DNA溶解于10ul無核酸酶水中；再用純化后的線性質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33；得到重組子。

(3)生物發(fā)酵表達(dá)豬EGF。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述豬EGF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述表達(dá)載體pJ912含有SmalI和PstI酶切位點(diǎn)、AOX1啟動(dòng)子、α因子分泌信號(hào)序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，電轉(zhuǎn)化時(shí)使用的電比色皿寬0.4cm，電轉(zhuǎn)化的條件為：電壓1.5kv，電擊4ms。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：電擊過程在冰上進(jìn)行。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)還包括將所述重組子涂布于YPD瓊脂培養(yǎng)基平板上篩選。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述YPD瓊脂培養(yǎng)基的成分包括1重量％酵母提取物、2重量％蛋白胨、2重量％瓊脂、1M山梨醇和100ug/ml博來霉素。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)還包括用以下引物對(duì)所述重組子進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，篩選出陽(yáng)性重組子；所述引物序列如下：

上游引物:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，

下游引物5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(3)的生物發(fā)酵表達(dá)條件為：甘油培養(yǎng)溫度為30℃，甲醇誘導(dǎo)溫度為25℃，甲醇誘導(dǎo)體積濃度為1％，pH值為5.5。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(3)的生物發(fā)酵表達(dá)條件為：甘油培養(yǎng)溫度為30℃，甲醇誘導(dǎo)溫度為26℃，甲醇體積濃度為2％，pH值為5.5。