[發明專利]海藻酸鈉接枝天然環糊精固定化細胞及其應用

有效

• 申請號: 201710452650.3
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107164360B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 王敏;申雁冰;于子棋;謝曉林;駱健美
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12P33/02
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物催化技術領域，具體涉及一種海藻酸鈉接枝天然環糊精固定化細胞及其應用。本發明構建的海藻酸鈉接枝天然環糊精固定化細胞首次實現環糊精介質及細胞的同時循環利用，在提高甾體底物溶解度的同時，達到促溶介質和催化細胞的重復使用，循環8次后甾體底物轉化率仍在90％以上，具有很好的應用價值和推廣前景。

技術領域：

本發明屬于生物催化技術領域，具體涉及海藻酸鈉接枝天然環糊精固定化細胞及其應用。

背景技術：

甾體化合物作為僅次于抗生素的第二大類藥物，其在生命體內具有調控各種物質代謝及生理作用的功能。甾體藥物的工業化生產主要是改造天然甾體化合物的結構，與傳統化學方法合成相比，微生物轉化的方法可以形成多種甾體藥物活性中間體且產物純度高。環糊精作為增溶劑能增加疏水性甾體的溶解度，其特殊空腔結構可以包結甾體底物，從而提高甾體化合物的生物利用度和產率。然而環糊精的價格較高制約了其在生物催化領域中的大范圍應用，采用合適的方法擴大環糊精在生物轉化反應中的應用是亟待解決的重要問題。

通過接枝技術將環糊精固載到殼聚糖、海藻酸鈉等高分子載體上，可以把β-環糊精從溶于水的粉體材料制備成不溶于水的高分子材料，克服環糊精難回收的缺陷，使其能夠循環利用，降低工業使用的成本。接枝后的環糊精仍保留獨特的空腔結構及其它優良性質，同時還擁有了高分子載體良好的機械性能、穩定性等特征，這大大拓寬了環糊精的應用空間，提升了它的應用價值。海藻酸鈉是一種天然聚陰離子多糖高分子化合物，由G、M兩個單元構成，遇水后表面具有粘性，會使得溶液也具有粘性。其安全無毒，成本低，生物可降解性以及生物相容性良好，具備藥用輔料所需的性質，遇到Ca²⁺、Zn²⁺等陽離子時，會發生化學反應形成凝膠球，針對這種性質，可用作藥物的緩釋和控釋材料，以及用于固定性質不穩定物質，提高穩定性，同時還可用于固定微生物、細胞、酶等，實現循環利用。目前海藻酸鈉的應用主要涉及到農藥、食品、生物醫藥等領域，也被逐漸延伸到重金屬污染的救治方面。

中國專利CN 105754984-A公布了海藻酸鈉復合固定化菌劑及其制備方法以及用途，公開了海藻酸鈉復合固定化菌劑及其制備方法，解決了現有技術中并沒有適用于二氯喹啉酸降解用假單胞菌的固定化方式的問題。本發明包括將具有假單胞菌的載體培養基和海藻酸鈉混合后，滴入濃度為1～4％的氯化鈣中靜置2～4h制成的顆粒劑；所述海藻酸鈉的質量濃度為2～6％；所述載體培養基包括吸附載體和無機鹽液體培養基；該吸附載體與海藻酸鈉的重量比為1～3:1,該吸附載體由重量比為1:1～2:1的玉米芯、竹炭和油枯組成。本發明通過有效提高菌體的降解效率；且本發明固定化菌劑的降解率遠遠高于空白小球物理吸附效率和游離菌株的生物降解效率之和，能有效達到相互促進的效果。

海藻酸鈉作為天然高分子載體，分子中含有-COOH和-OH兩種親水基團，具有較強的親水性，并且可以環氧氯丙烷為交聯劑與環糊精進行接枝，形成的環糊精-海藻酸鈉接枝物可以固定化細胞，實現環糊精和細胞的共循環。目前關于以海藻酸鈉作為載體，以天然高分子材料接枝環糊精的形式作為促溶劑運用于難溶化合物的生物轉化，并對環糊精及細胞進行共循環利用的技術尚未可見。

發明內容：

為了解決上述技術問題，本發明提供一種甾體生物催化反應中環糊精介質及催化細胞循環利用的方法，具體如下：

在甾體生物催化反應中，以環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠作催化劑，反應結束后，進行過濾，濾液用于收集反應產物，過濾物即環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，使用反應溶液洗滌1-8次后，重新用于甾體生物催化反應，從而實現環糊精介質及細胞循環利用；

所述反應溶液為Tris-HCl緩沖溶液、生理鹽水或純水等，pH7.0-pH7.6；

所述洗滌細胞膠珠的反應溶液的用量為每克細胞膠珠10-100mL；

所述環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠的制備方法如下：

(1)海藻酸鈉接枝環糊精