[發明專利]海藻酸鈉接枝天然環糊精固定化細胞及其應用

有效

• 申請號: 201710452650.3
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107164360B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 王敏;申雁冰;于子棋;謝曉林;駱健美
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12P33/02
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

1.一種甾體生物催化反應中天然環糊精介質及催化細胞循環利用的方法，其特征在于，具體如下：在甾體生物催化反應中，以天然環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠作催化劑，反應結束后，進行過濾，濾液用于收集反應產物，過濾物即環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，重新投入甾體生物催化反應，進行循環利用；

所述天然環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠的制備方法如下：

(1)海藻酸鈉接枝天然環糊精

按海藻酸鈉和天然環糊精按摩爾比1:0.2-1:1.5稱取海藻酸鈉和天然環糊精，加入三角瓶中，并加入海藻酸鈉45-55倍的蒸餾水，30-70℃水浴中攪拌使之完全溶解；

按環氧氯丙烷與蒸餾水體積比0.05-1:50加入環氧氯丙烷，同時按環氧氯丙烷與NaOH溶液體積比0.05-1:10滴加0.5mol/L的NaOH溶液，之后反應1.5-6.5h；

(2)固定化細胞膠珠的制備

待步驟(1)的反應液冷卻后，加入終濃度為1-30g/L的菌體靜息細胞，攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.1-0.5mol/L的CaCl₂溶液中，將膠珠在CaCl₂溶液中繼續浸泡1-6h，過濾，用反應溶液洗滌1-8次，即得環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠；

所述反應溶液為Tris-HCl緩沖溶液、生理鹽水或純水，pH7.0-pH7.6。

2.如權利要求1所述的一種甾體生物催化反應中天然環糊精介質及催化細胞循環利用的方法，其特征在于，天然環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠循環利用的次數為8次以上。

3.如權利要求1所述的一種甾體生物催化反應中天然環糊精介質及催化細胞循環利用的方法，其特征在于，所述的天然環糊精為α-環糊精、β-環糊精或γ-環糊精。

4.如權利要求1所述的一種甾體生物催化反應中天然環糊精介質及催化細胞循環利用的方法，其特征在于，所述天然環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠通過活化延長循環利用的次數，所述的活化方法具體如下：

(1)將催化效率降低的天然環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠10g，投入到30mL發酵培養基進行活化，160r/min，32℃的搖床下振蕩培養20h；

所述的發酵培養基為發酵培養菌體時使用的培養基；

(2)培養結束后將發酵液過濾得到膠珠，用反應溶液將膠珠洗滌干凈后，將其置于CaCl₂溶液中再次固定2h，反應溶液洗滌收集膠珠1-8次，置于4℃冰箱中保存備用。

5.如權利要求4所述的一種甾體生物催化反應中天然環糊精介質及催化細胞循環利用的方法，其特征在于，活化后環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠可再次循環利用3-5次。

6.如權利要求1所述的一種甾體生物催化反應中天然環糊精介質及催化細胞循環利用的方法，其特征在于，細胞膠珠使用反應溶液洗滌1-8次后，重新用于甾體生物催化反應，所述反應溶液為Tris-HCl緩沖溶液、生理鹽水或純水，pH7.0-pH7.6。

7.如權利要求6所述的一種甾體生物催化反應中天然環糊精介質及催化細胞循環利用的方法，其特征在于，所述洗滌細胞膠珠的反應溶液的用量為每克細胞膠珠10-100mL。