[發明專利]一種建立綠色熒光BALB/c裸小鼠模型的方法及模型應用

在審

• 申請號: 201710452157.1
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107439489A
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發明（設計）人: 董軍;陳延明;盛敏峰;薛彥平;劉加馳;黃強
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第二醫院
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12Q1/68
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙)11400
• 代理人: 邢若蘭,高之波

技術領域

本發明屬于醫療領域用動物模型領域，特別涉及小鼠模型。

背景技術

膠質瘤是顱內最常見的原發難治性腦腫瘤，目前國內、外各實驗室都在 廣泛開展膠質瘤的基礎研究，包括膠質瘤的發生機制、生物學行為、基因通 路與生物治療和基因治療等，在一定程度上提高了療效，并改善預后。作為 基礎研究的平臺，建立人腦膠質瘤原位移植模型至關重要。如今此類動物模 型研究雖比較成熟，但都存在一定缺陷：以普通BALB/c裸鼠建立的腫瘤 模型，不能很好的示蹤并分辨腫瘤和源于宿主的腫瘤微環境細胞；利用BALB /c裸鼠與免疫功能正常的熒光小鼠雜交而來的熒光裸鼠，因其遺傳學性狀 不穩定，其子代熒光表達并不穩定。為此，本發明旨在建立一種穩定表達綠 色熒光蛋白的近交系免疫缺陷小鼠，從而為直觀高效穩定地揭示腫瘤細胞與 宿主組織之間復雜的關系奠定基礎。

自從1907年美國杰克遜實驗室的C.Little首次培育出第一株近交系動 物DBA小鼠以來，近交系小鼠因為遺傳背景一致，體積小，繁育快，易于 重復操作，與人有許多共患疾病，而被做為醫藥研究的首選動物。一百年來， 近交系品種不斷增多，利用小鼠與人類類似疾病的特點在病因學、發病機制 及預后等領域作出了突出貢獻。1962年，英國格拉斯醫院Grist在近交系小 鼠中，偶然發現了個別先天性胸腺發育不良的裸鼠，由此產生了免疫缺陷動 物。人類細胞可以在免疫缺陷小鼠體內生存增殖，具有不同遺傳背景和不同 免疫缺陷表型的動物，大大推動了腫瘤學和免疫學等研究領域的發展。隨著 基因工程技術的發展，培育出的基因工程小鼠更具有應用價值，因而培育新 的實驗動物品種品系，更好的為實驗研究服務，目前依然是個十分重要的任 務。

目前轉基因綠色熒光小鼠因其全身組織器官均能發出綠色熒光，適用于 研究外源性組織或細胞(常用另一種熒光標記)在該小鼠體內與宿主(小鼠) 組織細胞相互作用的體內研究，但該小鼠因免疫功能健全，不能移植人的組 織或細胞于其體內并成活，因此無法用于人類組織細胞的體內熒光示蹤實驗 研究。

發明內容

為了解決上述問題，本發明建立了一個既與親本 C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)－樣穩定表達EGFP，又與免疫缺陷小鼠(BALB/c 背景)一樣具有免疫功能缺陷的近交新品系。利用同源導入法建立的新品系 穩定表達EGFP的模型小鼠，為人膠質瘤原位移植示蹤研究膠質瘤及其腫瘤 微環境奠定堅實基礎。

本發明我們利用C57BL/6綠色熒光蛋白轉基因小鼠和免疫功能缺陷 小鼠(BALB/c裸鼠)進行交配，通過動物雜交-回交的方式向其體內導入EGFP 基因，培育表達增強型綠色熒光蛋白基因的近交品系BALB/c裸鼠，并進一 步對其遺傳背景、生物學特征、綠色熒光蛋白表達規律進行了分析。在此基 礎之上，采用瘤細胞或者腫瘤組織塊接種的方式，建立了人腦腫瘤原位接種 動物模型，并對該模型的熒光表達強度及熒光穩定性、模型制備成功率、可 重復性等指標經行了評價，取得良好成果。

根據本發明的一個方面，提供了一種建立綠色熒光BALB/c裸小鼠模型 的方法，方法如下：

選取雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠與雄性Foxn1nu小鼠雜交得到F1 子代均為有毛熒光小鼠，篩選其中♀小鼠，待其性成熟后與親代♂Foxn1nu 交配(回交)得F2；產生F2子代性狀分離，篩選其中♀有毛熒光鼠與親代♂ Foxn1nu回交，完成一個回交循環；此回交循環過程一共進行10代，得到 F10，達到第十代符合標準,十代以后(包含第十代)就可以用于腫瘤示蹤研 究,建立綠色熒光BALB/c裸小鼠模型。

在一些實施方式中，在F10子代中篩選♀有毛熒光鼠與♂熒光裸小鼠雜 交，篩選其中熒光亮度高的子代，以此建立血緣擴大群及生產群。

在一些實施方式中，篩選其中♀有毛熒光鼠表型的鑒定方法為：孕鼠生 產后，利用有無體毛的特征來辨認新生仔鼠是否為裸小鼠，無毛為裸小鼠；

性別判斷方法為通過肛門與生殖器的距離辨別；熒光的初步判斷方法為 使用熒光成像儀判斷是否為發綠色熒光的熒光鼠。