[發(fā)明專利]一種利用改進的疊皿平板法篩選分離硫酸鹽還原菌的方法

有效

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• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107058108B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發(fā)明（設計）人: 王繼勇;陳加立;江英杰;肖挺
• 申請（專利權）人: 武漢理工大學
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明;閉釗

本發(fā)明涉及一種利用改進的疊皿平板法篩選分離硫酸鹽還原菌的方法，該方法首先通過硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)基對土壤中的微生物進行轉接篩選，接著采用改進后的稀釋涂布?疊皿夾層法以及篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，第三步利用普通疊皿雙層平板法分離純化上一步所得菌株，最后在保存培養(yǎng)基中保存培養(yǎng)。該方法克服了現(xiàn)有技術存在的菌液不能均勻地涂布滲透在第一層平板上、菌液稀釋后不利于其生長、菌落容易上下重疊甚至出現(xiàn)雜菌生長等不足，具有用材簡便、篩選效率高、篩選周期短、所得菌種轉化率高等優(yōu)點。

技術領域

本發(fā)明屬于環(huán)境微生物技術領域，具體涉及一種利用改進的疊皿平板法篩選分離硫酸鹽還原菌的方法。

背景技術

目前，運用生物工程等高科技生物技術，培育能夠用于固定重金屬的植物和土壤微生物超級工程菌，并運用于土壤污染治理是目前環(huán)境科學、環(huán)境工程學、植物生理學、微生物學等研究中最活躍的前沿領域之一。微生物能通過氧化還原、甲基化和去甲基化作用轉化重金屬，將有毒物質轉化成動植物不可利用的形態(tài)。

硫酸鹽還原菌(Sulfate-Reducing Bacterium，簡稱SRB下同)是自然界中能把硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等硫氧化物以及元素硫還原形成硫離子，由于重金屬硫化物的溶度積普遍較小，硫離子能夠立即與微量重金屬離子結合生成生物不能利用的形態(tài)，因此硫酸鹽還原菌可以用作處理固定環(huán)境中的重金屬離子。SRB菌在工業(yè)管道的腐蝕、受重金屬污染的廢水及酸性礦山廢水的環(huán)境修復中都扮演著重要角色。

SRB為嚴格的厭氧菌，但隨著研究的深入，已有研究結果表明SRB并非嚴格意義上的絕對厭氧而是兼性厭氧，但總體上來說SRB對氧還是極其敏感的，因此對其培養(yǎng)與分離關鍵要采用嚴格的厭氧技術。SRB可選用的培養(yǎng)方法有很多，例如疊皿夾層法、稀釋搖管法、Hungate滾管技術，還可以利用厭氧袋、厭氧罐、厭氧手套箱等。稀釋搖管法的不足之處是觀察與挑取菌落比較困難，Hungate滾管法以及利用厭氧設備的方法則受到技術方法和設備材料成本的制約，而疊皿夾層法實質是將菌夾在上下兩層培養(yǎng)基之間，使其造成一個相對無氧的環(huán)境，從而使SRB能在夾縫中生長。疊皿夾層法的優(yōu)點是培養(yǎng)物均采用涂布生長于營養(yǎng)瓊脂夾層中，取菌落時可很方便地做到定點取菌，同時該方法不需要另外創(chuàng)建一個無氧環(huán)境，省時、省力，容易實現(xiàn)的同時具備了所有好氧、厭氧分離方法的優(yōu)點。

然而傳統(tǒng)的疊皿夾層法分離菌一般不能均勻地涂布滲透在第一層平板上，且菌液經(jīng)過稀釋后氧化還原電位會隨著稀釋倍數(shù)的增大而升高，對于硫酸鹽還原菌的生長很不利。此外在第二層瓊脂層的倒入過程中稀釋液會隨著擴散入第二層中，從而出現(xiàn)菌落上下重疊甚至出現(xiàn)雜菌生長的第二層表面的現(xiàn)象，不易獲得單菌落，給分離和篩選菌落帶來一定的難度。為了繼承傳統(tǒng)厭氧培養(yǎng)分離法的優(yōu)點，克服其缺點，本發(fā)明根據(jù)科研實際需要對硫酸鹽還原菌(SRB)的稀釋涂布-疊皿夾層法分離培養(yǎng)方法進行了改進。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有硫酸鹽還原菌篩選技術存在的上述問題，提供一種從土壤中富集并利用改進后的疊皿平板法篩選、分離、純化出有較高重金屬離子耐受性的硫酸鹽還原菌的方法。該方法操作更加簡便，提高了篩選分離的效率，縮短了篩選分離周期。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案如下：

一種利用改進的疊皿平板法篩選分離硫酸鹽還原菌的方法，包括以下步驟：(a)將預處理后的土壤加入到硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)基中進行厭氧培養(yǎng)，所得富集液接種至新的硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)基中再次進行厭氧培養(yǎng)，轉接培養(yǎng)多次后得到富集菌液；(b)將富集菌液稀釋成不同濃度，向其中加入L-半胱氨酸、抗壞血酸和硫酸亞鐵銨備用，將篩選培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待其冷凝后分別將不同濃度的稀釋液涂布在平板上，待稀釋液滲透后先后兩次倒入篩選培養(yǎng)基，冷凝后依次形成第二層、第三層，將培養(yǎng)皿密閉后恒溫培養(yǎng)；(c)將滅菌后的篩選培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中冷凝備用，挑取步驟(b)第二層菌株生長層中生長明顯的黑色單菌，在新配制的平板上劃線分離，再將篩選培養(yǎng)基倒入劃線分離后的平板上，密封后反復多次分離培養(yǎng)；(d)將劃線分離得到的單菌落接種到保存培養(yǎng)基內(nèi)，恒溫培養(yǎng)即得。