[發明專利]一種利用改進的疊皿平板法篩選分離硫酸鹽還原菌的方法

有效

• 申請號: 201710452128.5
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107058108B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 王繼勇;陳加立;江英杰;肖挺
• 申請（專利權）人: 武漢理工大學
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明;閉釗

1.一種利用改進的疊皿平板法篩選分離硫酸鹽還原菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（a）將預處理后的土壤加入到硫酸鹽還原菌液體富集培養基中進行厭氧培養，所得富集液接種至新的硫酸鹽還原菌液體富集培養基中再次進行厭氧培養，轉接培養多次后得到富集菌液；

（b）將富集菌液稀釋成不同濃度，向其中加入L-半胱氨酸、抗壞血酸和硫酸亞鐵銨備用，將篩選培養基倒入培養皿中，待其冷凝后分別將不同濃度的稀釋液涂布在平板上，待稀釋液滲透后先后兩次倒入篩選培養基，冷凝后依次形成第二層、第三層，將培養皿密閉后恒溫培養；

（c）將滅菌后的篩選培養基倒入培養皿中冷凝備用，挑取步驟（b）第二層菌株生長層中生長明顯的黑色單菌，在新配制的平板上劃線分離，再將篩選培養基倒入劃線分離后的平板上，密封后反復多次分離培養；

（d）將劃線分離得到的單菌落接種到保存培養基內，恒溫培養即得；

所述篩選培養基的成分包括：0.4-0.6g/L的K₂HPO₄, 0.1-0.2g/L 的CaCl₂，0.8-1.0g/L的NH₄Cl，1-2g/L的MgSO₄·7H₂O，1-2g/L的NaCl，0.4-0.6g/L的Na₂SO₄, 2.0-3.0g/L的C₃H₅O₃Na, 0.5-0.6g/L的L-半胱氨酸，0.5-0.6g/L的抗壞血酸，0.5-0.6g/L 的Fe(NH₄₎₂(SO)₂以及2wt%的瓊脂；配制時先將其他原料混合并在121℃下滅菌20min，接著降溫至55℃后加入L-半胱氨酸、抗壞血酸、Fe(NH₄)₂(SO₄)₂，調節pH至8.0-8.5。

2.根據權利要求1所述的一種利用改進的疊皿平板法篩選分離硫酸鹽還原菌的方法，其特征在于，所述硫酸鹽還原菌液體富集培養基的成分包括：0.4-0.6g/的K₂HPO₄，1-2 g/L的MgSO₄·7H₂O，0.4-0.6g/L的Na₂SO₄，0.1-0.2g/L的CaCl₂，1-2 g/L的NaCl，0.8-1.0g/L的NH₄Cl，1.0-2.0g/L的酵母膏，配制好后在121℃下滅菌20min，調節pH至8.0-8.5。

3.根據權利要求1所述的一種利用改進的疊皿平板法篩選分離硫酸鹽還原菌的方法，其特征在于，所述保存培養基的成分包括：0.5-0.7g/L的K₂HPO₄, 0.1-0.2g/L 的CaCl₂，1-1.2g/L的NH₄Cl，1-2 g/L的MgSO₄·7H₂O，2-3 g/L的NaCl，0.4-0.6g/L的Na₂SO₄, 3.0-4.0g/L的C₃H₅O₃Na, 0.5-0.6g/L的L-半胱氨酸，0.5-0.6g/L的抗壞血酸，配制時先將其他原料混合并在121℃下滅菌20min，接著降溫至55℃后加入L-半胱氨酸、抗壞血酸，調節pH至8.0-8.5。

4.根據權利要求1所述的一種利用改進的疊皿平板法篩選分離硫酸鹽還原菌的方法，其特征在于：步驟（a）中首先用篩網對土壤樣品進行篩選預處理，接著按照1g:200-220mL的比例將土壤加入到滅菌后的硫酸鹽還原菌液體富集培養基中，在其表面覆蓋一層液體石蠟并充氮氣，放入30℃的恒溫搖床中以100-120r/min的轉速進行厭氧培養。