[發明專利]一種分選胎兒有核紅細胞的方法

在審

• 申請號: 201710448537.8
• 申請日: 2017-06-14
• 公開（公告）號: CN107312748A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 趙興中;魏小云;黃琴琴
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/078;G01N33/543
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙)42222
• 代理人: 彭勁松

技術領域

本發明屬于胎兒有核紅細胞分選領域，具體涉及一種從孕婦外周血中在優化密度后的Percoll溶液中基于抗原抗體特異性識別和細胞密度差異來分選胎兒有核紅細胞的方法。

背景技術

鑒于優生優育，人們對產前診斷的要求越來越迫切。有創傷性的產前診斷技術如羊水穿刺、絨毛穿刺等由于需要從胎兒組織取樣從而具有較高的流產風險，對母體和胎兒造成危害尤其是對于高齡產婦而言。所以無創傷性的產前診斷技術成為當今研究熱點。胎兒有核紅細胞(Fetal nucleated red blood cells，FNRBC)是一種單核細胞，于孕6周至分娩后幾個月內持續存在于母體外周血中，細胞生命周期短；含有胎兒基因的全部遺傳信息，便于遺傳學和分子生物學分析。因此，被認為是最好的產前診斷材料，從孕婦外周血中分離胎兒有核紅細胞為無創傷性產前診斷開辟了新途徑。

近年來，許多研究都致力于胎兒有核紅細胞的富集。由于胎兒有核紅細胞在孕婦外周血中的數量極少，通常孕婦外周血中胎兒有核細胞與孕婦有核細胞的比例約為1：10⁶，高效率和高純度的分選一直是一個難題。傳統的分選方法可以分為兩種：(1)利用細胞的物理性質如尺寸、密度和變形性等來進行分選如密度梯度離心法；篩孔過濾法；(2)利用抗原抗體特異性標記如熒光素激活細胞分類法(FACS)和免疫磁珠細胞分選(MACS)。其中，傳統的密度梯度分選方法利用胎兒有核紅細胞與外周血細胞(如紅細胞、白細胞和血小板等)密度之間微小的差別來進行分層分選，由于它們之間存在著一個重疊的范圍，單純基于細胞密度分選的純度不高，因此，基于物理性質的分選方法面臨著一定程度的細胞損失和純度不高的問題；FACS分選純度高，但儀器昂貴，技術復雜。而MACS純度較低，存在一定的弊端。

發明內容

為了克服現有技術存在的缺陷，本發明提供了一種分選過程簡單、方便、易操作、特異性強且成本低的分選胎兒有核紅細胞的方法。

為了實現以上目的，本發明具體技術方案如下：

第一方面，本發明提供一種分選及鑒定胎兒有核紅細胞的方法，包括如下步驟：

1)優化可進行密度分選的Percoll溶液：從美國Sigma公司購買的Percoll原液的密度是1.13g/ml，使用2.5M(1.316g/ml)的蔗糖溶液以1:9體積比例濃縮Percoll原液，得到密度為1.15g/ml的Percoll溶液；

2)制備具有明膠表面的二氧化硅微球SiO₂@Gel：

a.稱取0.1g粒徑為30μm，密度為2.0g/ml的二氧化硅微球分散在50ml無水乙醇中，50-80℃水浴條件下滴加0.5ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷磁力攪拌2-4h，然后經過無水乙醇、去離子水洗滌3次后得到氨基修飾的二氧化硅微球NH₂-SiO₂；

b.將NH₂-SiO₂重新分散在50ml去離子水中，加入0.5mL濃度為50％的戊二醛，室溫攪拌8-13h，離心收集到的微球經過去離子水離心洗滌3次后得到醛基修飾的二氧化硅微球CHO-SiO₂；

c.將CHO-SiO₂再次分散到濃度為1％的明膠溶液，室溫攪拌2-5h后用去離子水離心洗滌3次得到表面均勻包裹上一層10-50nm明膠的二氧化硅微球SiO₂@Gel；

步驟2)個步驟中的離心轉速設定為1000轉/分鐘。

3)制備抗體anti-CD147修飾的SiO₂@Gel微球：

a.用嗎啉乙磺酸(MES)溶液洗滌SiO₂@Gel微球三次，然后將SiO₂@Gel微球浸泡在適量MES溶液中；

b.在a中的微球溶液里分別加入EDC和NHS，反應20-40min后，用PBS洗滌3遍；

c.將b處理的微球浸入鏈霉親和素溶液中，過夜處理，用PBS洗滌；

d.對c處理的微球進行anti-CD147修飾1-3h，抗體anti-CD147的濃度優選為20μg/ml，用PBS洗滌得到抗體修飾的SiO₂@Gel微球；

4)分選胎兒有核紅細胞：