[發明專利]一種分選胎兒有核紅細胞的方法

在審

• 申請號: 201710448537.8
• 申請日: 2017-06-14
• 公開（公告）號: CN107312748A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 趙興中;魏小云;黃琴琴
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/078;G01N33/543
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙)42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種分選及鑒定胎兒有核紅細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）優化可進行密度分選的Percoll溶液：從美國Sigma公司購買的Percoll原液的密度是1.13g/ml，使用2.5M密度為1.316g/ml的蔗糖溶液以1:9體積比例濃縮Percoll原液，得到密度為1.15g/ml的Percoll溶液；

2）制備具有明膠表面的二氧化硅微球SiO₂@Gel：

a. 稱取0.1g粒徑為30μm，密度為2.0g/ml的二氧化硅微球分散在50ml無水乙醇中，50-80℃水浴條件下滴加0.5ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷磁力攪拌2-4h，然后經過無水乙醇、去離子水洗滌3次后得到氨基修飾的二氧化硅微球NH₂-SiO₂；

b.將NH₂-SiO₂重新分散在50ml去離子水中，加入0.5mL 濃度為 50%的戊二醛，室溫攪拌8-13h，離心收集到的微球經過去離子水離心洗滌 3 次后得到醛基修飾的二氧化硅微球CHO-SiO₂；

c.將CHO-SiO₂再次分散到濃度為1%的明膠溶液，室溫攪拌2-5h后用去離子水離心洗滌 3 次得到表面均勻包裹上一層 10-50nm 明膠的二氧化硅微球 SiO₂@Gel；

步驟2）個步驟中的離心轉速設定為 1000轉/分鐘；

3）制備抗體anti-CD147修飾的SiO₂@Gel微球：

a.用嗎啉乙磺酸（MES）溶液洗滌SiO₂@Gel微球三次，然后將SiO₂@Gel微球浸泡在適量MES溶液中；

b.在a中的微球溶液里分別加入EDC和NHS，反應20-40min后，用PBS洗滌3遍；

c.將b處理的微球浸入鏈霉親和素溶液中，過夜處理，用PBS洗滌；

d.對c處理的微球進行anti-CD147修飾1-3h，抗體anti-CD147的濃度優選為20μg/ml，用PBS洗滌得到抗體修飾的SiO₂@Gel微球；

4）分選胎兒有核紅細胞：

將含有胎兒有核紅細胞的1毫升樣品與10⁵/毫升抗體修飾的SiO₂@Gel微球在細胞混勻儀室溫下攪拌30min，轉速設定為10rpm，混勻孵育得到混合樣品，加入到步驟1）通過優化密度后的Percoll溶液，在400g離心15min，，在離心管底部收集到捕獲細胞的微球；

5）胎兒有核紅細胞的無創傷性釋放：

將收集的捕獲到胎兒有核紅細胞的二氧化硅微球SiO₂@Gel用明膠酶進行降解釋放胎兒有核紅細胞；

6）釋放下來的胎兒有核紅細胞的鑒定：

以激發波長不同的熒光染料分別標記的胎兒紅細胞血紅蛋白抗體和胎兒有核紅細胞膜蛋白抗體作為雙抗體，結合DAPI，對步驟5）釋放的胎兒有核紅細胞進行識別，以雙抗體同時標記為陽性且細胞核在紫外光激發下呈藍色作為胎兒有核紅細胞鑒定的標準。

2.根據權利要求1所述的分選及鑒定胎兒有核紅細胞的方法，其特征在于，步驟4）使用SiO₂@Gel微球濃度在10⁵/毫升左右，抗體anti-CD147 濃度為使用無菌PBS將抗體anti-CD147 母液稀釋至濃度為20微克/毫升。

3.根據權利要求1所述的分選及鑒定胎兒有核紅細胞的方法，其特征在于，步驟5）中所述的明膠酶優選為基質金屬蛋白酶9。