[發明專利]一種妊娠期尼古丁暴露對胎兒腦損傷的體外模型構建方法

有效

• 申請號: 201710447086.6
• 申請日: 2017-06-14
• 公開（公告）號: CN109082405B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 秦建華;王亞清
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12M3/00
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

本發明提供了一種妊娠期尼古丁暴露對胎兒腦損傷的體外模型建立方法，其主要步驟分為：(1)微流控芯片的制備；(2)三維類腦在微流控芯片上的發育；(3)施加尼古丁暴露。該方法主要結合了新興的hiPSCs來源的三維類腦組織和可灌流的微流控芯片，通過加以不同濃度的尼古丁刺激，模擬妊娠期尼古丁暴露對胎兒早期腦發育的影響。該模型作為創新的體外器官發育疾病模型，不僅利于直觀觀察尼古丁對腦發育的形態學影響，也可以借鑒各種檢測方法，研究尼古丁對腦發育影響的分子學和細胞學機制。本發明并且很好地模擬了腦早期發育的微環境，可替代動物模型和傳統的二維培養方式，為研究妊娠期尼古丁對胎兒早期腦發育的影響提供了有力的新平臺。

技術領域

本發明涉及微流控芯片技術和組織工程的領域，具體涉及一種妊娠期尼古丁暴露對胎兒腦損傷的體外模型構建方法。

背景技術

病理條件下組織和器官的分子和細胞水平機制研究能更好地了解、控制和治療疾病。傳統的生物學方法用于疾病的機制研究或建立疾病模型主要包括二維細胞培養方式和動物模型。二維細胞培養無法模擬生理條件下細胞的微環境，不能完全反映細胞在病理條件下的形態學和分子水平的改變。動物實驗目前主要是使用鼠、果蠅、線蟲等模式生物，雖然模式生物來源方便、培養條件簡單，但由于種屬差異，它們很難完全反映各種條件下人體各器官和組織的生理變化。而對于人體的研究在保證最低損傷和方便觀察的前提下，較為常用的有核磁共振、CT等，但是這些方法不具實時監測特點，并且很多都無法應用于胎兒發育。

近幾年來各種干細胞來源的類腦發育得到了有效發展，包括神經干細胞、腸干細胞、胚胎干細胞以及誘導多能干細胞iPSCs。類腦的形成來源于擬胚體EBs，是由干細胞特異性分化并自組裝成具有三維結構的多細胞聚集體，在體外進一步發育成具有一定結構和功能特異性的組織，一定程度上模擬了早期腦發育的過程。類腦技術在模擬腦發育，藥物篩選和細胞替代療法以及疾病模型的建立和研究等方面提供了一個獨特的平臺，彌補了二維細胞培養分化以及動物模型存在種間差異的不足，具有廣泛的應用前景。

盡管這類技術有潛在的優勢和應用，仍然面臨很多局限和不足。首先，由于三維細胞團的結構特點，使得內部細胞由于缺少氧氣和營養，出現中心細胞壞死現象，極大限制了類腦發育的程度，包括體積大小、功能成熟度等，而在生理情況下組織和腦中分布著血管網絡用于提供充分的氧氣和營養物質，是傳統方法很難實現的。其次，傳統方法中如使用旋轉反應器培養類腦需要消耗大量的培養基和培養空間，成本較高并且可操作性不強，不利于施加不同的條件刺激。最后，傳統方法主要是利用細胞自組裝和化學因子誘導形成類腦，沒有時空上的因素控制及物理因素的參與。因此，結合現有的工程化手段尤其是微流控技術，有望優化類腦技術。

微流控芯片作為細胞培養載體，有幾大優勢：首先，借助微流控芯片技術可根據實際應用設計不同的通道尺寸，提供一定的空間限制即物理因素控制，并維持細胞的三維生長狀態。其次，流體控制有助于促進營養物質和氧氣的交換，減少細胞凋亡或細胞團中心壞死現象，為細胞培養提供良好的生存環境。最后，PDMS作為微流控芯片的制作材料，具有良好的透光和透氣性，可進行細胞的實時監測和觀察并有利于細胞對氧氣的充分利用，維持細胞的生長狀態。但是目前將微流控技術與類腦技術相結合，建立人屬的疾病模型領域尚屬空白。

發明內容

本發明的目的是提供一種妊娠期尼古丁暴露對胎兒腦損傷的體外模型建立方法，該方法使用微流控芯片灌流系統通過三維培養和流體控制等要素，模擬體內腦發育的微環境，不僅保證了發育過程中充分的營養物質和氧氣的交換，實現了腦早期發育特征，并具有低成本、易操作、可原位示蹤和實時監測的特點。

本發明一種妊娠期尼古丁暴露對胎兒腦損傷的體外模型建立方法，其步驟主要分為三部分：(1)微流控芯片的制備；(2)三維類腦在微流控芯片上的發育；(3)施加尼古丁暴露。

所述步驟(1)微流控芯片的制備，具體為：