[發明專利]一種妊娠期尼古丁暴露對胎兒腦損傷的體外模型構建方法

有效

• 申請號: 201710447086.6
• 申請日: 2017-06-14
• 公開（公告）號: CN109082405B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 秦建華;王亞清
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12M3/00
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

1.一種妊娠期尼古丁暴露對胎兒腦損傷的體外模型建立方法，其特征在于其該方法主要步驟分為：

（1）微流控芯片的制備；所述微流控芯片包括：細胞外基質混懸液入口（1）、三維通道（2）、二維灌流通道（3）、二維培養基通道（4）、培養液入口（5），所述二維灌流通道（3）、二維培養基通道（4）和三維通道（2）交界處有小柱形狀的連通處，可用于營養物質傳輸；所述微流控芯片的二維灌流通道（3）和二維培養基通道（4）的寬度都為0.5 mm-1 mm，三維通道的寬度為1.5 mm-2.5 mm，所有通道的高度均為600-800 um；

（2）三維類腦在微流控芯片上的發育；

（3）施加尼古丁暴露;

步驟（3）施加尼古丁暴露，具體為：

（1）類腦發育第11天時，轉移到微流控芯片上，并進行灌流操作，此時施加尼古丁暴露；

（2）對照組使用NDM培養基，樣品組使用含尼古丁濃度為0.5-50 uM 的NDM培養基；

（3）樣品組的芯片的所有培養基通道均置換為含尼古丁的NDM；

（4）尼古丁處理至三維類腦發育16-30天時，進行后續檢測;

尼古丁的濃度范圍為0.5-50 uM，以模擬生理情況下的尼古丁濃度;

步驟（2）三維類腦在微流控芯片上的發育，具體為：

（1）將2×10⁵~6×10⁵個干細胞消化成單細胞加入帶有坑狀結構的PDMS芯片中形成擬胚體EBs，并加入神經誘導培養基NIM進行誘導；EBs在NIM中培養到第11天時，將EBs轉移到微流控芯片上，使用濃度為2-10 mg/ml的Matrigel重懸EBs，并用100 ul的去尖槍頭將EBs注入微流控芯片的三維通道內，將含有EBs的微流控芯片置于37℃培養箱30-40 min，使Matrigel凝固；將培養基通道內補加神經分化培養基NDM，靜止培養6-8 h；

（2）靜止培養后進行灌流操作，將微流控芯片的二維灌流通道連接注射器和注射泵，設置流速20-40 ul/h，將芯片放入培養箱中進行灌流培養，繼續培養15-30天后，并實時追蹤，鑒定發現微流控芯片上的EBs可以進行持續的生長和分化，經鑒定可以形成含有不連續的特定腦區及類似大腦皮層結構的類腦，可模擬早期的腦發育過程；

所述NDM培養基，所用培養基為神經分化培養基 ，其基礎成分為體積比為1:1的DMEM/F12和Neuralbasal medium，另外需添加占總體積1％ B27（50×），占總體積0.5％N2（100×），占總體積0.5％ NEAA（100×），占總體積1％GlutaMAX（100×），占總體積1％penicillin-streptomycin（100×），0.05 mM beta-mercaptoethanol；

所述NIM培養基的基礎成分為DMEM/F12，另外需添加占總體積1％N2（100×），占總體積1％GlutaMAX（100×），占總體積1％NEAA （Non Essential Amino Acid，100×），1 μg/mlheparin，占總體積1％penicillin-streptomycin（100×）。

2.按照權利要求1所述妊娠期尼古丁暴露對胎兒腦損傷的體外模型建立方法，其特征在于步驟（1）所述微流控芯片制備：由上下兩層不可逆封接而成，上下層材料均為聚二甲基硅氧烷的聚合物，封接之后，經過高溫高壓滅菌處理備用。

3.按照權利要求1所述妊娠期尼古丁暴露對胎兒腦損傷的體外模型建立方法，其特征在于：所述干細胞為胚胎干細胞或誘導多能干細胞。