[發明專利]果蔬中六種食源性致病菌多重LAMP檢測引物、檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201710446459.8
• 申請日: 2017-06-14
• 公開（公告）號: CN107022644B
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 王文博;劉賓;苑學霞;李瑞菊
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/14;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/445;C12R1/42;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

本發明公開了一種果蔬中六種食源性致病菌多重LAMP檢測引物、檢測試劑盒及檢測方法，屬于細菌基因檢測技術領域。本發明設計得到單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌O157:H7六種致病菌的快速檢測引物組，對待測樣品中所提取的細菌的基因組DNA利用包含上述引物組的檢測試劑盒在同一反應體系中進行多重LAMP反應來判定樣品中是否含有上述六種食源性致病菌。檢測引物具有高特異性和高靈敏度，能在同一反應體系中準確檢測上述六種食源性致病菌基因組DNA。可以實現簡便、快速、準確檢測，適于現場快速檢測，對于提高致病菌分析檢測技術和果蔬食用質量安全具有重要意義。

技術領域

本發明涉及細菌基因檢測技術領域，具體地涉及一種果蔬中單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌O157:H7六種食源性致病菌多重LAMP檢測的檢測引物、及其檢測試劑盒和檢測方法。

背景技術

作為全球性問題，食源性疾病廣泛地威脅公共安全，由果蔬攜帶致病微生物引發疾病的現象也呈逐年增多的趨勢。近年來隨著國民經濟的發展，對新鮮農產品的需求日益增加，然而生鮮果蔬特別是綠葉蔬菜很容易傳播致病菌和病毒，很難通過常規方法清洗干凈。因此，利用致病菌快速檢測技術在果蔬上市之前快速抽檢，確保入市產品安全無害具有重要意義。

單增李斯特菌 (Listeria monocytogenes)是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界中，被WHO劃列為重點監測的食源性致病菌之一，目前也是我國重點關注的標準外微生物風險因子之一。阪崎腸桿菌是腸桿菌科的一種，能引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結腸炎和菌血癥，死亡率高達50% 以上。志賀氏菌（Shigella spp）屬革蘭氏染色陰性腸桿菌，是人類細菌性痢疾最常見的病原菌。近年來，志賀氏菌Ⅰ型的細菌性痢疾已發展為世界性流行趨勢，我國至少在十余個省區發生了不同規模流行。金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）隸屬于葡萄球菌屬，革蘭氏染色呈陽性。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛生難題，我國每年發生的此類中毒事件也非常多。沙門氏菌（Salmonella spp）是公共衛生領域的重要致病菌，屬革蘭氏染色陰性腸桿菌。據統計在世界各國發生的細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，我國內陸地區所發生的細菌性食物中毒中也以沙門氏菌為首要原因。大腸埃希氏菌O157:H7是大腸桿菌中的一個亞型，雖然生長在健康人類和動物的腸道內的絕大多數菌種都是無害的，但這一菌種卻會產生強烈的毒素，并引發嚴重的疾病。

按照現行的風險評估監測體系要求，有多類食品均需對上述六種食源性致病菌進行檢測以排除其污染。現有技術的常規檢測多采用傳統培養方法，每個致病菌需應用獨立的檢測方法單獨進行檢測，費時費力，靈敏度低不能滿足快速檢測的需求，且受到檢測人員專業背景、檢測經驗等多種因素影響，容易出現誤判。增加了企業的儲藏成本和質量控制成本，及政府對于食品安全的監管難度。

隨著分子生物學方法在食品微生物檢測中的逐步應用，致病菌的檢測效率也逐步提升，但目前所采用的常規單重 PCR方法不能實現多種目標菌的同時檢測，仍存在較大工作量。多重PCR 技術能在同一PCR反應體系內實現對多種目標DNA 的同步快速擴增，為病原微生物的鑒定提供了快速，靈敏，特異的方法。鑒于多重PCR技術有眾多優勢，現已被逐漸應用于病原微生物的檢測。二重和三重PCR檢測屢有相關報道。但由于多重PCR影響因素復雜，不同的引物、模板、引物濃度、模板濃度、Mg²⁺濃度、dNTP濃度及其比例等會產生復雜的綜合效應，因此所同時檢測的目標微生物種類越多，PCR體系建立的難度越大。