[發明專利]一種藥食真菌菌絲多糖多肽免疫增強劑的制備方法

有效

• 申請號: 201710445560.1
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN107541533B
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 劉瑩瑩;肖毅;肖兵南;蔣小文
• 申請（專利權）人: 湖南民康生物技術研究所
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C12P21/00;C07K1/14;C07K1/30;C07K1/34;C08B37/00;A61K36/07;A61K39/39;A61P37/04
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏;周棟

1.一種藥食真菌菌絲多糖多肽免疫增強劑的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)菌絲發酵物的制備：以液態深層發酵方法培養食藥真菌菌絲, 25-30℃，100-180r/min培養2-4d，制備食藥真菌菌絲發酵物，包括菌絲與發酵液, 所述食藥真菌菌絲為松乳菇、金針菇、香菇、猴頭菇或松茸；

(2)多糖多肽提取：取液體菌絲發酵物經研磨和高壓均漿處理，使菌絲體破碎，加0.05-0.2％(w/v)的復合酶，進行第一次酶解，所述復合酶為纖維素酶和果膠酶的混合物，所述復合酶中纖維素酶：果膠酶為1.5:3，酶解條件為：pH為5，溫度為50℃，時間為2-3h, 后80-90℃滅活10-20min；用木瓜蛋白酶第二次酶解，酶解條件為：pH為7.0，溫度為50℃，時間為2-3h，用酶量32萬U/100ml；后微波或超聲波處理，微波時間為120S～180S，超聲波條件為：超聲波功率為400W，溫度為50-60℃，時間為40-60min；再過濾，離心，離心條件為：轉速為4000-5000rpm，時間為10-20min ,得多糖與多肽粗提取液；

(3)多糖多肽分離：粗提液減壓濃縮，加乙醇至乙醇體積百分比濃度為70-75％，攪勻，靜止沉淀過夜，使提取液中的多糖和多肽初步分離，得作為沉淀物的粗多糖和作為上清液的粗多肽；

(4)粗多糖多肽純化：

1)粗多糖的純化：將乙醇沉淀物水溶解，4號垂溶漏斗過濾后取濾液；加鹽酸左旋咪唑使其體積百分比濃度為0.1-0.5％，煮沸15min，靜置過夜，使蛋白與鹽酸左旋咪唑結合沉淀，取上清液，280nm處測定無蛋白，離心；將上清液用堿調pH至7-8，按體積加入2-8％過氧化氫(w/v) ,于50-70℃脫色2-3h；加石油醚和氯仿分次脫脂、脫色和萃取殘存左旋咪唑；超濾去除細菌和大分子物質；于60-80℃減壓濃縮或納濾膜過濾濃縮后進行冷凍干燥或真空干燥，或超濾后直接噴霧干燥，制得無菌純化真菌多糖；

2)粗多肽的純化：取乙醇沉淀的上清液低溫減壓回收乙醇，再用體積百分比濃度為80％、85％、90％、95％的乙醇依次沉淀，至無大分子蛋白和多糖的沉淀后，于50-70℃減壓回收乙醇；用香草醛比色法或尼羅紅染色法檢測，如有脂肪存在，再經乙醇、丙酮、乙醚分步脫脂；配制成水溶液，加0.5-1.5％活性炭脫色，脫色條件為攪拌2h，靜置10min，后超濾去除細菌和大分子物質；濾液經納濾膜過濾濃縮或50-70℃減壓濃縮后進行冷凍干燥或真空干燥；制得無菌純化真菌多肽；

(5)復合免疫增強劑配伍制劑：

1)粉針制劑：將所得的無菌純化真菌多糖、真菌多肽按質量比(2-5)：(1-5)配伍，無菌分裝，制得藥食真菌菌絲多糖多肽免疫增強粉針劑；

或將所得的無菌純化真菌多糖、真菌多肽按質量比(2-5)：(1-5)配伍，無菌分裝，再按質量百分比加1-5％注射用鹽酸左旋咪唑制備左旋咪唑多糖多肽粉針；

臨用時用注射用水或生理鹽水配制；

2)水針制劑：將純化多糖多肽按質量比(2-5)：(1-5)取樣，配制成10-30％(w/v)水溶液，超濾膜過濾，在無菌條件下分裝于經高壓消毒的藥瓶內，巴氏消毒老化一體機中進行巴氏消毒，制備多糖多肽注射液；

或將多糖多肽注射液中再加入0.1-1.0％(w/v)鹽酸左旋咪唑，并用鹽酸作穩定劑，下調PH值1-2至pH為4-6.5，溶解混勻，過濾，分裝，消毒，制備左旋咪唑多糖多肽注射液。

2.一種藥食真菌菌絲多糖多肽免疫增強劑,其特征在于,所述藥食真菌菌絲多糖多肽免疫增強劑的制備方法如權利要求1所述。