[發明專利]一種細胞周期阻滯劑6BAR在人乳腺癌細胞中的應用

在審

• 申請號: 201710445304.2
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN107326010A
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 王黎;程嬌;崔昌浩;林凡琳;張瀚文;于冬麗;鄧營營
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 大連理工大學專利中心21200
• 代理人: 溫福雪,侯明遠

1.一種細胞周期阻滯劑6BAR在人乳腺癌細胞株中的應用，其特征在于，步驟如下：

(1)細胞復蘇：將裝有凍存人乳腺癌細胞株MCF7的凍存管從-80℃冰箱中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕微搖動，待液體融化；將凍存管中的人肺癌細胞株A549懸浮于含有10％滅活胎牛血清的無菌RPMI 1640培養液的離心管中，1000rpm，5min離心，離心結束后，棄上清，輕輕彈起細胞，再次入無菌RPMI 1640培養液與離心管中，把細胞懸浮起來，轉移到培養瓶中左右輕輕搖動，使培養瓶中的細胞均勻分布，得到復蘇的人乳腺癌細胞株MCF7；

(2)細胞培養：將復蘇的人乳腺癌細胞株MCF7置于濃度為5％CO₂、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養箱中培養，10h后觀察細胞，若已貼壁，將培養液全部吸出，再次加入等量的RPMI 1640培養液；待細胞長至培養瓶底面積的70％～80％傳代1次；

(3)藥物配制：6BAR先用0.1％DMSO溶解，繼續用無菌RPMI 1640培養基將用0.1％DMSO溶解好的6BAR稀釋，使6BAR溶液的母液濃度達到1mM，繼續用無菌RPMI 1640培養基將溶解好的6BAR溶液的母液稀釋至濃度為1μM-500μM，過濾除菌，室溫保存；

(4)處理細胞：將處于對數生長期的細胞用胰酶消化，細胞計數后，稀釋，稀釋細胞密度為3×10⁴～5×10⁴個/ml，吹打混勻，將細胞接種于96孔板中，每孔取100μl人乳腺癌細胞株MCF7，12h后，待細胞貼壁后，設置7組實驗，每組4個復孔，第1組：空白對照組；第2組：0.1％DMSO組；第3組：100μΜ6BAR組；第4組：50μΜ6BAR組；第5組：10μΜ6BAR組；第6組：5μΜ6BAR組；第7組：1μΜ6BAR組；分別向各組中加入10μl對應的藥物，輕輕混勻后，置于濃度為5％CO₂、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養箱中孵育2天，檢測細胞增殖抑制活性；

(5)檢測細胞增殖抑制率：將步驟(4)處理后的細胞，置于濃度為5％CO₂、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養箱中孵育48h，各4個復孔；采用MTT試劑盒進行檢測，每孔細胞懸液中加20μl MTT溶液，置于37℃，CO₂培養箱中孵育3h，測定490nm處各組細胞的吸光度，記錄數據；

(6)檢測細胞周期：將處于對數生長期的細胞用胰酶消化，細胞計數后，取適量細胞進行稀釋，稀釋細胞密度為1×10⁵～1.5×10⁵個/ml，吹打混勻，將細胞接種于6孔板中，每孔取2ml人乳腺癌細胞株MCF7，12h后，待細胞貼壁后，設置空白對照組和10μΜ6BAR組，向10μΜ6BAR組中加入6BAR，使6BAR的濃度為10μΜ，輕輕混勻后，置于濃度為5％CO₂、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養箱中孵育36h，用15ml離心管分裝成兩個樣品，按照細胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書固定細胞并配制碘化丙染色緩沖液，12h后，每個樣品中加入PBS洗多次，重懸細胞，每個樣品加入所需碘化丙染色緩沖液37℃避光孵育30min，最后用PBS洗兩次；300目篩網過濾后用BD FACSCalibur流式細胞儀上機檢測。