[發明專利]支氣管原代上皮細胞的培養與鑒定方法

在審

• 申請號: 201710445036.4
• 申請日: 2017-06-12
• 公開（公告）號: CN107236700A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 吳衛東;李海斌;劉影影;謝冬;安珍;李文;曾樣
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司11514
• 代理人: 孟凡臣

1.支氣管原代上皮細胞的培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、用膠原蛋白鋪滿器皿的表面，包被處理后備用；

S2、經支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細胞，用一次性吸液管吹吸離心管內毛刷數次后，加入培養基內，點到包被好的培養皿中間培養至細胞鋪滿整個細胞孔；

S3、用胰蛋白酶－EDTA消化液消化細胞孔，轉移到細胞培養瓶細胞培養箱培養，1-2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞瓶。

2.如權利要求1所述的支氣管原代上皮細胞的培養方法，其特征在于，步驟S1的詳細過程為：用無菌0.006-0.008mol/L乙酸將膠原蛋白稀釋到0.03-0.05mg/mL，在12孔板內每孔加300-400uL，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置1-2小時后，用保護性毛刷洗3-5次后，在超凈臺中利用風機吹干并用紫外消毒30-40min后使用。

3.如權利要求2所述的支氣管原代上皮細胞的培養方法，其特征在于，所述膠原蛋白為鼠尾膠原蛋白。

4.如權利要求1所述的支氣管原代上皮細胞的培養方法，其特征在于，步驟S2的詳細過程為：經支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細胞，力道均勻刷3-4次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有RPMI1640培養液的離心管內；用一次性吸液管吹吸離心管內毛刷數次后，1000-1200rpm離心10-15分鐘，去上清后加入150-170uL BEGM培養基，吸取30-50uL點到包被好的細胞培養皿中央，放到細胞培養箱培養4小時；取出以后加入500-600uL培養基，放細胞培養箱中培養，1-2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞孔。

5.如權利要求4所述的支氣管原代上皮細胞的培養方法，其特征在于，所述細胞培養箱培養條件為37℃、5％CO₂。

6.如權利要求1所述的支氣管原代上皮細胞的培養方法，其特征在于，步驟S3的詳細過程為：用胰蛋白酶－EDTA消化液消化細胞孔5-10min，加入1mLRPMI1640培養液終止消化后，1500-1700rpm離心5-10分鐘，去上清后加入1mLBEGM培養基，1600-1800rpm離心5-10分鐘，去上清后加入4mLBEGM培養基，轉移到25cm²細胞培養瓶，放置細胞培養箱培養，1-2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞瓶。

7.如權利要求6所述的支氣管原代上皮細胞的培養方法，其特征在于，胰蛋白酶－EDTA消化液的質量分數為0.25％。

8.支氣管原代上皮細胞的鑒定方法，其特征在于，包括細胞免疫組化染色鑒定方法。

9.如權利要求8所述的支氣管原代上皮細胞的鑒定方法，其特征在于，具體步驟為：

兔抗人的角蛋白8單克隆抗體標記支氣管上皮細胞：將爬片用無水乙醇洗三次，每次浸泡5min，然后取出爬片，自然晾干，把消化好的支氣管上皮細胞離心、計數以后，取5萬個細胞，接種于爬片上進行培養，定期光鏡下觀察，待爬片長滿細胞以后，爬片制作完成→4％多聚甲醛固定20min→PBS洗5min*3次→5％牛血清白蛋白室溫孵育1小時→PBS洗5min、3次→1:20稀釋一抗，取30ul，將爬片正面向下貼合一抗，放于濕盒中4℃冰箱孵育一整夜→PBS洗5min、3次→加入檢測試劑山羊抗兔IgG/HRP聚合物15min→PBS洗5min、3次→DAPI染色7min→PBS洗5min、3次→90％甘油封片→倒置相差顯微鏡下觀察。