[發明專利]支氣管原代上皮細胞的培養與鑒定方法

在審

• 申請號: 201710445036.4
• 申請日: 2017-06-12
• 公開（公告）號: CN107236700A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 吳衛東;李海斌;劉影影;謝冬;安珍;李文;曾樣
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司11514
• 代理人: 孟凡臣

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種支氣管原代上皮細胞的培養與鑒定方法。

背景技術

人支氣管上皮細胞主要功能：(1)支氣管表面的上皮細胞構成了基底柱狀結構，清除粘液纖毛。(2)由纖毛、無纖毛和能分泌黏液的細胞等混合細胞群組成物理屏障，可有效防止多種有毒物質。(3)產生和分泌大量化學介質和細胞因子形成高度復雜的宿主防御系統。人支氣管上皮細胞與主要病理生理疾病有關，如支氣管肺癌(多簡稱為肺癌)、慢性支氣管炎、支氣管擴張、支氣管狹窄。為了獲得體外穩定傳代的人正常支氣管上皮細胞，使人們可以更全面地研究細胞的正常功能，疾病發病機理，組織器官功能重建或再造，以及測定藥物對正常細胞的毒性，研究人員做出了大量的工作。

目前，傳統培養方法主要為：原代細胞的分離培養、ALI培養基添加成分、預鋪膠原類型的選擇、細胞的接種密度等各不相同。

傳統培養方法缺陷在于：體外培養支氣管原代上皮細胞的存活率非常低。因此，有必要提供一種支氣管原代上皮細胞的培養與鑒定方法，提高體外培養支氣管原代上皮細胞的存活率。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明提供支氣管原代上皮細胞的培養與鑒定方法，以提高支氣管原代上皮細胞體外培養的成活率。

第一方面，本發明提供了支氣管原代上皮細胞的培養方法，包括如下步驟：

S1、用膠原蛋白鋪滿器皿的表面，包被處理后備用；

S2、經支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細胞，用一次性吸液管吹吸離心管內毛刷數次后，加入培養基內，點到包被好的培養皿中間培養至細胞鋪滿整個細胞孔；

S3、用胰蛋白酶－EDTA消化液消化細胞孔，轉移到細胞培養瓶細胞培養箱培養，1-2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞瓶。

本發明中，作為一種優選的技術方案，步驟S1的詳細過程為：用無菌0.006-0.008mol/L乙酸將膠原蛋白稀釋到0.03-0.05mg/mL，在12孔板內每孔加300-400uL，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置1-2小時后，用保護性毛刷洗3-5次后，在超凈臺中利用風機吹干并用紫外消毒30-40min后使用。

本發明中，作為一種優選的技術方案，所述膠原蛋白為鼠尾膠原蛋白(索萊寶)。

本發明中，作為一種優選的技術方案，步驟S2的詳細過程為：經支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細胞，力道均勻刷3-4次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有RPMI1640培養液的離心管內(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內毛刷數次后，1000-1200rpm離心10-15分鐘，去上清后加入150-170uL BEGM培養基，吸取30-50uL點到包被好的細胞培養皿中央，放到細胞培養箱培養4小時；取出以后加入500-600uL培養基，放細胞培養箱中培養，1-2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞孔。

本發明中，作為一種優選的技術方案，所述細胞培養箱培養條件為37℃、5％CO₂。

本發明中，作為一種優選的技術方案，步驟S3的詳細過程為：用胰蛋白酶－EDTA消化液消化細胞孔5-10min，加入1mL RPMI1640培養液終止消化后，1500-1700rpm離心5-10分鐘，去上清后加入1mLBEGM培養基，1600-1800rpm離心5-10分鐘，去上清后加入4mLBEGM培養基，轉移到25cm²細胞培養瓶，放置細胞培養箱培養，1-2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞瓶。

本發明中，作為一種優選的技術方案，胰蛋白酶－EDTA消化液的質量分數為0.25％。

第二方面，本發明提供了支氣管原代上皮細胞的鑒定方法，包括細胞免疫組化染色鑒定方法。

本發明中，作為一種優選的技術方案，細胞免疫組化染色鑒定方法的具體步驟為：