[發(fā)明專利]Taqman-MGB探針檢測(cè)綿羊BMPR-IB基因A746G突變的試劑盒和方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710444692.2
• 申請(qǐng)日: 2017-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN107338287B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊華;楊永林;李良遠(yuǎn);盧守亮;楊涵羽璐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新疆農(nóng)墾科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 趙徐平

1.檢測(cè)綿羊BMPR-IB基因A746G突變的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含陽性對(duì)照、DNA提取液Ⅰ、DNA提取液Ⅱ、2×LightCycler 480 probes master、一對(duì)引物BMF和BMR，以及其對(duì)應(yīng)的探針BPA和BPG、ddH₂O；

其中DNA提取液Ⅰ、DNA提取液Ⅱ，其組成成分如下：

DNA提取液Ⅰ：0.01mol/L Tris，0.01mol/L NaCL，0.005～0.01mol/L MgCl₂﹒6H₂O；

DNA提取液Ⅱ：10mmol/L Tris，0.1mmol/L EDTA-Na₂﹒2H₂O，0.1～1％TritonX-100；

其上游引物BMF的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

其下游引物BMR的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；

其野生探針BPA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；

其突變探針BPG的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；

所述野生探針BPA的5’一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)1，3'一端標(biāo)記有MGB淬滅基團(tuán)；所述突變探針BPG的5’一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)2，3'一端標(biāo)記有MGB淬滅基團(tuán)；

其中所述的熒光基團(tuán)1或熒光基團(tuán)2為FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一種，且熒光基團(tuán)1與熒光基團(tuán)2不相同。

2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒中所包含的陽性對(duì)照樣品為三個(gè)，分別對(duì)應(yīng)綿羊BMPR-IB基因的++、B+和BB三種基因型。

3.一種利用權(quán)利要求2所述試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)從綿羊血液中提取基因組DNA:

(a)取無菌的1.5ml離心管，向其中加入混勻的EDTA抗凝血200μl和DNA提取液Ⅰ溶液600μl，充分混勻,室溫靜置10min；將離心管置于離心機(jī)中，6000rpm離心1min；

(b)取出離心管，傾去上清液，保留沉淀；向離心管中加入DNA提取液Ⅱ溶液60μl，充分振蕩混勻；沸水浴中10min；

(c)取出離心管，置離心機(jī)中，12,000rpm離心10min，離心后上清液可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

(2)將步驟(1)得到的DNA加入到PCR反應(yīng)液中，取所述引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得綿羊的BMPR-IB基因包含A746G突變位點(diǎn)的基因片段；

(3)根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)對(duì)綿羊BMPR-IB基因A746G位點(diǎn)的三種基因型進(jìn)行判定，即++、B+和BB基因型。

4.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟(2)中實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)所使用的擴(kuò)增體系為20μL，擴(kuò)增體系中包含以下溶液或試劑：2×LightCycler 480 probesmaster 10μL，10μmol/L上游引物BMF 0.8μL，10μmol/L下游引物BMR 0.8μL，10μmol/L野生探針BPA0.4μL，10μmol/L突變探針BPG0.4μL，基因組DNA3μL，去離子水補(bǔ)齊至20μL。

5.如權(quán)利要求3或4所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟(2)中實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)所使用的擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性10min；95℃變性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1sec，45個(gè)循環(huán)。