[發明專利]一種環境中微生物群落結構的絕對豐度測定方法

有效

• 申請號: 201710443973.6
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN107287293B
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發明（設計）人: 汪海珍;樓駿;楊黎;吳勞生;徐建明
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;G16B30/10
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本發明公開了一種環境中微生物群落結構的絕對豐度測定方法，先提取環境樣品中的DNA，獲取DNA樣品，通過實時熒光定量PCR方法測定DNA樣品中的分類基因總濃度，再通過第二代高通量測序方法獲得環境樣品中微生物不同界、門、綱、目、科、屬、種的分類基因相對豐度，最后將DNA樣品的分類基因總濃度與微生物不同界門綱目科屬種的分類基因的相對豐度相乘，計算得到微生物不同界門綱目科屬種的分類基因的絕對豐度，實現了微生物群落結構絕對豐度的高通量快速測定，使得跨樣本比較更為可靠，實質反映物種的增長與減少，為進一步探究微生物群落結構提供技術支撐。

技術領域

本發明涉及微生物生態學領域，具體涉及一種環境中微生物群落結構的絕對豐度測定方法。

背景技術

微生物是生態環境系統中重要的組成部分，在地球物質循環和能量流動中發揮了至關重要的作用，因其豐富的物種多樣性，基因多樣性及生態系統多樣性，具有較大的挖掘潛質，一直備受研究者關注。據估計，地球中微生物數量約為4-6×10³⁰個細胞，種類多達10⁶種。

對微生物群落結構的研究是環境微生物生態學的研究基礎，在過去的百年中，科學家對于環境微生物群落結構進行了廣泛的研究，研發了例如平板計數、顯微鏡觀察、磷脂脂肪酸分析、變性梯度凝膠電泳等多種方法。這些方法都有其優勢，例如平板計數，可以非常直觀的觀察到環境微生物群落結構中不同的微生物以及其數量。但是由于環境中可培養的微生物僅有1％-15％，極大的限制了平板計數的觀察能力。

近些年來隨著第二代高通量測序技術，如Illumina測序平臺等的發明，使得基因測序的通量極大的提高，最高一天可達1.5Gb數據量。這也讓應用第二代高通量測序技術研究微生物群落結構的方法替代了先前的研究方法，成為了研究環境細菌群落結構最新的研究方法。然而，第二代高通量測序技術只能獲取DNA樣品序列數量，從而算出環境細菌群落結構的百分比信息，換而言之，只能獲取環境微生物群落結構相對豐度信息。

描述生態學研究主要有三個要素分別為物種絕對豐度、相對豐度以及物種種類數。三者之間相互關聯，但又彼此獨立。主要體現在相對豐度可以通過單個物種的絕對豐度除以整個群體總量來換算成單個物種的相對豐度。但是兩者對于描述單個物種的功能不同，絕對豐度可以用于描述單個物種的絕對含量，表征其在不同或相同的環境群落里數量的增減；相對豐度主要用于描述單個物種占整個環境群落的百分比，描述單個物種的優勢程度，而無法用于跨樣本間的比較。例如，物種X在樣本A和樣本B中分別占有10％和3％的比例，當樣本A、B微生物總量一致時，A樣本中的物種X絕對豐度多于B樣本；若A樣本(10⁸cellsg^-1)中微生物總量少于B樣本(10⁹cells g^-1)時，A樣本中的物種X絕對豐度則少于B樣本。

由于受到技術等方面的限制，研究者只能借助高通量測序手段獲得群落結構的相對豐度信息，以此來表征環境微生物的增減變化，為更為精確和快速的表征環境微生物的群落結構變化，亟待開發一種既能快速獲得微生物群落結構信息，同時能準確了解微生物群落結構絕對豐度信息的技術，從而彌補現有技術方法的不足，對于更為全面研究與了解環境微生物群落結構及其生態學具有十分重要的意義。

發明內容

本發明提供了一種環境中微生物群落結構的絕對豐度測定方法，有利于完善環境細菌絕對豐度、群落結構及數量生態學的研究，從而進一步研究利用環境細菌。

本發明提供一種環境中微生物群落結構的絕對豐度測定方法，包括如下步驟：

(1)提取環境樣品中的DNA，獲取DNA樣品；

(2)通過實時熒光定量PCR(qPCR)方法測定DNA樣品中的分類基因總濃度；

(3)通過第二代高通量測序方法對DNA樣品進行分類基因擴增子高通量測序，獲得環境樣品中微生物不同分類單元(界、門、綱、目、科、屬、種)的分類基因相對豐度；