[發明專利]一種環境中微生物群落結構的絕對豐度測定方法

有效

• 申請號: 201710443973.6
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN107287293B
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發明（設計）人: 汪海珍;樓駿;楊黎;吳勞生;徐建明
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;G16B30/10
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

1.一種環境中微生物群落結構的絕對豐度測定方法，包括如下步驟：

（1）提取環境樣品中的DNA，獲取DNA樣品；

（2）通過實時熒光定量PCR方法測定DNA樣品中的分類基因總濃度；

所測微生物為細菌或古菌時，分類基因為16S rRNA基因；所測微生物為真菌時，分類基因為ITS基因；

所述的步驟（2）中，包括如下步驟：

（2-1）制備質粒標準樣品；

（2-2）計算質粒標準品的拷貝數；

（2-3）樣品分類基因濃度實時熒光定量PCR測定；

所述的樣品分類基因濃度實時熒光定量PCR測定包括如下步驟：

（2-3-1）將已知濃度的質粒標準品通過10倍梯度稀釋，構建濃度為10⁹， 10⁸， 10⁷， 10⁶，10⁵， 10⁴， 10³，10² copies μL^-1標準曲線標準樣；

（2-3-2）將土壤樣品DNA與10倍梯度稀釋質粒標準樣一同進行實時熒光定量PCR測定，獲得Ct值；

（2-3-3）利用統計學中的線性回歸方法將10倍梯度稀釋質粒標準樣的Ct值與拷貝數對數進行方程擬合，得到標準曲線；

（2-3-4）將土壤DNA樣品Ct值代入（2-3-3）中標準曲線中，計算DNA樣品分類基因濃度；

（3）通過第二代高通量測序方法對DNA樣品進行分類基因擴增子高通量測序，獲得環境樣品中微生物不同界、門、綱、目、科、屬、種的分類基因相對豐度；

（4）將步驟（2）的DNA樣品的分類基因總濃度與步驟（3）的微生物不同界門綱目科屬種的分類基因的相對豐度相乘，計算得到微生物不同界門綱目科屬種的分類基因的絕對豐度，從而獲得環境中微生物群落的絕對豐度。

2.根據權利要求1所述的環境中微生物群落結構的絕對豐度測定方法，其特征在于，所述的步驟（1）中，采用MoBio PowerSoil^? DNA提取試劑盒提取環境樣品中的DNA。

3.根據權利要求1所述的環境中微生物群落結構的絕對豐度測定方法，其特征在于，所述的（2-1）制備質粒標準樣品包括如下步驟：

（2-1-1）選用相應的引物對分類基因進行PCR擴增，獲取目的基因片段；

（2-1-2）采用TA克隆試劑盒將（2-1-1）中目的基因片段與質粒載體相連，并將該質粒載體導入DH5α感受態細胞中；

（2-1-3）將（2-1-2）中50 μL含有質粒的DH5α感受態細胞置于300 μL液體LB培養基中，在37 ℃、250 rpm條件下培養1 h；

（2-1-4）吸取200 μL（2-1-3）中培養液，涂布于含有終濃度為100 μg mL^-1氨芐青霉素的LB固體培養基上，37 ℃靜置過夜培養；

（2-1-5）隨機挑選6-8個重組單克隆菌落分別渦旋于10 μL無菌水中；

（2-1-6）分別吸取1 μL（2-1-5）中菌懸液作為模板采用M13引物：正向引物為5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；反向引物為5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’，進行PCR擴增，并對所得的PCR產物進行測序，剩余9 μL菌懸液加于含有氨芐青霉素濃度為100 μg mL^-1液體LB培養基中，37 ℃、250 rpm條件下培養12-18 h后，吸取500 μL菌液保存于-80 ℃環境中；

（2-1-7）將測定序列結果與NBCI數據中序列進行BLAST比對，選擇1株成功導入分類基因序列的重組單克隆菌株；

（2-1-8）吸取200 μL（2-1-7）中所選取的重組單克隆菌株，加入20 mL含有氨芐青霉素濃度為100 μg mL^-1液體LB培養基中37 ℃、250 rpm條件下培養12-18 h；

（2-1-9）吸取4 mL（2-1-8）中菌液進行質粒提取，獲得質粒標準品。