[發(fā)明專利]用于BRAFV600E基因突變的試劑盒及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710443065.7
• 申請(qǐng)日: 2017-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN107177682A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韋玉軍;李航;王娟;蘇軍;吳遠(yuǎn)航
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽安龍基因醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及的是用于BRAF V600E基因突變的試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

目前，肺癌己成為全球癌癥死亡的首要原因，全球每年新發(fā)病例150萬，嚴(yán)重威脅人類健康。在肺癌患者中，非小細(xì)胞肺癌約(NSCLC)占80％，且就診時(shí)80％己失去手術(shù)或放射治療最佳機(jī)會(huì)，致使其長(zhǎng)期生存率低，療效令人堪憂。IIIB/IV期非小細(xì)胞肺癌2年生存率僅10％-20％，中位生存時(shí)間僅10-12月。因此，人們需要不斷研究新的治療方法以提高肺癌治療的有效率，其中以分子靶向治療為代表的新治療方法，為晚期NSCLC的治療帶來了新的希望。

甲狀腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。2010年甲狀腺癌的發(fā)病率均居所有女性惡性腫瘤的前十位。隨著人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變，平均壽命的提高，甲狀腺癌的發(fā)病率可能還將進(jìn)一步上升。在常規(guī)健康體驗(yàn)中，有很多人會(huì)被查出甲狀腺結(jié)節(jié)，“良性還是惡性？”是大家最關(guān)心的問題。目前，B超引導(dǎo)下穿刺涂片檢查是鑒別結(jié)節(jié)良惡性的主要手段。但受多種因素的影響，不少結(jié)節(jié)依靠穿刺涂片檢查仍無法定性。

有一種叫做BRAF的原癌基因，該基因的突變與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，最常見于甲狀腺乳頭狀癌和皮膚黑色素瘤。乳頭狀癌約占所有甲狀腺癌的85％以上。發(fā)現(xiàn)并鑒定BRAF突變是近年來甲狀腺癌研究領(lǐng)域的重大進(jìn)展。一般認(rèn)為，與沒有BRAF突變的甲狀腺癌相比，檢出BRAF突變的甲狀腺癌惡性程度更高，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)也更大。

突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refraCtory mutation system，ARMS)也叫等位基因特異性PCR，該法是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而成的，是一種直接用于點(diǎn)突變分析的PCR技術(shù)。其依據(jù)的基本原理是Taq DNA聚合酶缺少3′到5′外切酶活性，因此對(duì)于3′末端錯(cuò)配的引物以低于正常末端配對(duì)引物的速度延伸，當(dāng)錯(cuò)配堿基的數(shù)目達(dá)到一定程度或者條件達(dá)到一定的嚴(yán)謹(jǐn)程度時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)終止。

BRAF基因是EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路重要成員，參與和調(diào)控細(xì)胞的增值分化和增長(zhǎng)全過程。大部分腫瘤的突變都是體細(xì)胞突變，突變細(xì)胞往往與野生型細(xì)胞混雜在一起。因此所提取的DNA常帶有大量野生型DNA，所以對(duì)體細(xì)胞突變檢測(cè)需要較高的特異性，而目前廣泛使用的直接測(cè)序法檢測(cè)能力有限，不能完全滿足臨床需要。特異性探針法如以Scorpions ARMS為代表的英國DxS和中國廈門Adx的BRAF V600E檢測(cè)試劑盒雖然檢測(cè)靈敏度高，但其檢測(cè)費(fèi)用較高，不適合國內(nèi)NSCLC患者的常規(guī)檢測(cè)和篩查，因此，臨床迫切需要開發(fā)一種快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的檢測(cè)BRAF V600E基因突變的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)BRAF V600E基因突變的試劑盒成本過高的不足，提供了一種用于BRAF V600E基因突變的試劑盒，本發(fā)明的另一目的在于，提供一種用于BRAF V600E基因突變的檢測(cè)方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

用于BRAF V600E基因突變的試劑盒，其特征在于：包括BRAF V600E基因突變檢測(cè)的特異引物和探針，其特異引物與探針包括如下序列：

優(yōu)選的，所述的探針5’端FAM熒光素，3’端標(biāo)記MGB猝滅熒光素。

優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括BRAF V600E突變及BRAF野生型PCR反應(yīng)液、酶系1、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和DEPC水。

優(yōu)選的，還應(yīng)包括可用于血清游離DNA樣本、組織樣本或穿刺樣本的BRAF V600E基因突變的檢測(cè)。

作為優(yōu)選，還應(yīng)包括如下擴(kuò)增體系：

一種BRAF V600E基因突變的檢測(cè)方法，所述的方法包含以下步驟：

(1)樣本DNA的提取

血清游離DNA提取：推薦使用Sigma公司的GenEluteTMPlasma/Serum Cell-Free Circulating DNA Purification Midi Kit。

組織樣本DNA提取：推薦使用QIAgene公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(貨號(hào)：56404)

(2)PCR反應(yīng)體系的配制

在試劑配制室按照試劑盒說明書要求進(jìn)行配制，PCR反應(yīng)液16ul，酶系1

2ul、引物探針混合液2ul，模板DNA5ul，陰性對(duì)照和質(zhì)控視為樣本，作相同處理。

(3)結(jié)果判讀：