[發明專利]一種胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶突變體及其基因和應用

有效

• 申請號: 201710441642.9
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN107502601B
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發明（設計）人: 張會圖;路福平;張瑩;孫同韋
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體內容涉及一種對胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶lipY2?m突變體K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G及其基因和應用。本發明的三個突變體的胰蛋白酶抗性均有明顯提高，經相同濃度的胰蛋白酶處理后，lipY2?m的抗胰蛋白酶半衰期為41.5min，K36G/K39T的抗胰蛋白酶半衰期為43.9min；R63G的抗胰蛋白酶半衰期為45.7min；組合突變體K36G/K39T/R63G的抗胰蛋白酶半衰期為46.8min，對胰蛋白酶抗性的半衰期分別提高了5.8％、10.1％和12％，顯示出了在治療胰腺功能不全等疾病方面的潛在應用價值。

技術領域

本發明屬于蛋白質工程和酶工程技術領域，具體內容涉及一種胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶lipY2-m突變體K36G/K39T/R63G及其基因和應用。

背景技術

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)又稱甘油酯水解酶，它是一類特殊的酯鍵水解酶，與只能在單相催化底物反應的酯酶不同，脂肪酶在其催化過程中需要有界面，這個界面分隔兩個物理相，在分子水平上是一至兩層有序的相鄰分子層，一層親水，一層疏水。它在油水界面可催化甘油三酯的水解生成脂肪酸、甘油、甘油單酯或二酯。同時脂肪酶在疏水介質中還可催化酯化、轉酯、酯交換等反應。

脂肪酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，大多數微生物脂肪酶的最適pH作用范圍在中性或偏堿性，少數為酸性。細菌脂肪酶最適pH在4.0-11.0，真菌脂肪酶最適pH在4.0-10.0，其中真菌脂肪酶具有在有機溶劑中高活性，且提取成本比較低的優點。因此，脂肪酶在飼料添加劑、食品加工、生物制藥等諸多領域有廣泛的應用。

脂肪酶是人體內脂肪代謝所必須的酶，若缺失將會引起健康問題。通過外部口服脂肪酶，可以幫助人體內的脂肪消化，同時脂肪酶還可以用于惡性腫瘤的治療。血液中的脂肪酶還可以用于胰臟疾病的診斷，當胰臟發生病發后，血液中的脂肪酶含量顯著上升。慢性胰腺炎等胰腺疾病往往會導致胰腺外分泌功能不全和減少脂肪消化酶的產生，這反過來又會導致脂肪吸收不良，腹瀉和營養不良。目前主要的治療方法是每餐胰脂肪酶代替療法，即口服補充脂肪酶來治療胰腺功能不全。而代替脂肪酶必須通過食道，胃和十二指腸才能到達小腸發揮作用。一般情況下正常人胃的平均pH為3，然而大部分脂肪酶在低pH值下很不穩定，甚至可能失活。當食物從胃中被轉移到十二指腸后，許多脂肪酶的活性又會被膽汁鹽所抑制。

據報道，來源于耶氏解酯酵母的酸性脂肪酶lipY2在較低pH值下仍表現出較高的活性和穩定性，且活性幾乎不受膽鹽的影響。正由于lipY2獨特的生化特性，使其成為胰脂肪酶替代療法的一個理想的候選酶。然而，這種酶的實際效果往往因為其很容易被胰蛋白酶所降解而降低。脂肪酶普遍存在于自然界中，但目前已確定的脂肪酶不是對膽鹽和消化酶敏感就是在較低的pH值下很不穩定，它們沒有一個整合這些所有的優勢。因此，利用蛋白質工程手段對lipY2進行酶分子改造，提高其在腸道中對胰蛋白酶水解的抗性至關重要。

隨著蛋白質工程技術和分子生物學的發展，運用定向進化和理性設計的手段對酶分子進行改造已成為當前酶工程領域研究的熱點。

發明內容

本發明的目的是通過定點突變的方法對脂肪酶進行改造，使改造后的脂肪酶在對胰蛋白酶的抗性上性質更加優良。

本發明的另一目的是提供編碼上述突變的脂肪酶lipY2-m突變體K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G的基因。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組質粒。

本發明還提供了一種工程菌株，其含有如前所述的脂肪酶lipY2-m突變體K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G的基因或如前所述的重組質粒。

本發明實現目的的技術方案如下：