[發(fā)明專利]用于人類KRAS基因突變檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710437605.0
• 申請(qǐng)日: 2017-06-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107164495A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韋玉軍;李航;劉文干;蘇軍;吳遠(yuǎn)航
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽安龍基因醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種用于人類KRAS基因突變檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

目前，肺癌己成為全球癌癥死亡的首要原因，全球每年新發(fā)病例150萬(wàn)，嚴(yán)重威脅人類健康。在肺癌患者中，非小細(xì)胞肺癌約(NSCLC)占80％，且就診時(shí)80％己失去手術(shù)或放射治療最佳機(jī)會(huì)，致使其長(zhǎng)期生存率低，療效令人堪憂。IIIB/IV期非小細(xì)胞肺癌2年生存率僅10％-20％，中位生存時(shí)間僅10-12月。因此，人們需要不斷研究新的治療方法以提高肺癌治療的有效率，其中以分子靶向治療為代表的新治療方法，為晚期NSCLC的治療帶來(lái)了新的希望。

ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的基因有三種——H-ras、K-ras和N-ras，分別定位在11、12和1號(hào)染色體上。K-ras因編碼21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，K-Ras對(duì)人類癌癥影響最大，它好像分子開(kāi)關(guān)：當(dāng)正常時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的路徑；發(fā)生異常時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，并阻止細(xì)胞自我毀滅。她參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，當(dāng)K-ras基因突變時(shí)，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的ras蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控而癌變。

K-ras基因就像體內(nèi)一個(gè)“開(kāi)關(guān)”，它在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及血管生成等過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著重要調(diào)控作用，正常的K-ras基因可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而一旦發(fā)生突變，它就會(huì)持續(xù)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，打亂生長(zhǎng)規(guī)律，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

K-ras基因檢測(cè)是目前醫(yī)生了解大腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法。看K-ras基因有沒(méi)有突變，可以篩選出抗EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)靶向藥物治療有效的大腸癌患者，實(shí)現(xiàn)腫瘤病人的個(gè)體化治療，從而延長(zhǎng)患者生存期。對(duì)于沒(méi)有突變的患者，則能減少不必要的治療費(fèi)用和毒副作用。目前在歐美，K-ras檢測(cè)已成為大腸癌患者內(nèi)科治療前必做的常規(guī)檢查。

突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refraCtory mutation system，ARMS)也叫等位基因特異性PCR，該法是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而成的，是一種直接用于點(diǎn)突變分析的PCR技術(shù)。其依據(jù)的基本原理是Taq DNA聚合酶缺少3′到5′外切酶活性，因此對(duì)于3′末端錯(cuò)配的引物以低于正常末端配對(duì)引物的速度延伸，當(dāng)錯(cuò)配堿基的數(shù)目達(dá)到一定程度或者條件達(dá)到一定的嚴(yán)謹(jǐn)程度時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)終止。

大部分腫瘤的突變都是體細(xì)胞突變，突變細(xì)胞往往與野生型細(xì)胞混雜在一起。因此所提取的DNA常帶有大量野生型DNA，所以對(duì)體細(xì)胞突變檢測(cè)需要較高的特異性，而目前廣泛使用的直接測(cè)序法檢測(cè)能力有限，不能完全滿足臨床需要。特異性探針?lè)ㄈ缫許corpions ARMS為代表的英國(guó)DxS和中國(guó)廈門(mén)Adx的KRAS檢測(cè)試劑盒雖然檢測(cè)靈敏度高，但其檢測(cè)費(fèi)用較高，不適合國(guó)內(nèi)NSCLC患者的常規(guī)檢測(cè)和篩查，因此，臨床迫切需要開(kāi)發(fā)一種快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的檢測(cè)KRAS基因突變的試劑盒，滿足臨床用藥和檢測(cè)診斷的時(shí)效性要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種高靈敏度的用于人類KRAS基因突變檢測(cè)的試劑盒和反應(yīng)體系，本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測(cè)KRAS基因突變的檢測(cè)方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：用于人類KRAS基因突變檢測(cè)的試劑盒，其特征在于：包括7種基因的特異性引物對(duì)和7條與特異性引物配合使用的探針引物，所述的特異性引物對(duì)和探針引物為：

優(yōu)選的，還包括質(zhì)控系統(tǒng)或/和內(nèi)控系統(tǒng)，所述的質(zhì)控系統(tǒng)為一對(duì)質(zhì)控引物和相應(yīng)的質(zhì)控探針，所述的內(nèi)控系統(tǒng)為一對(duì)內(nèi)控引物和相應(yīng)的內(nèi)控探針，具體如下：質(zhì)控引物：

上游引物：5’AATATAAACTTGTGGTAGTTGGA3’

下游引物：5’TTCGTCCACAAAATGATTCTGA3’

質(zhì)控探針：5’CTGTATCGTCAAGGCACTCTT3’；

內(nèi)控引物：

上游引物：5’CCCAGCAGTTTGGCCC3’

下游引物：5’TCCTTAATGTCACGCACGAT3’

內(nèi)控探針：5’ACCACCACGGCCGAGCGG3’。

優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括KRAS PCR反應(yīng)液、酶系1、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和DEPC水。

優(yōu)選的，所述的試劑盒可用于血清游離DNA樣本、組織樣本或穿刺樣本的KRAS基因突變的檢測(cè)。