[發明專利]基于堿基編輯的基因敲除方法及其應用

在審

• 申請號: 201710437122.0
• 申請日: 2017-06-12
• 公開（公告）號: CN107164377A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 李廣磊;尚小云;張琳琳
• 申請（專利權）人: 王小平
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N5/10
• 代理公司: 北京迎碩知識產權代理事務所(普通合伙)11512
• 代理人: 張群峰,錢揚保

技術領域

本發明涉及基因敲除策略，更具體來說，涉及基于堿基編輯的基因敲除方法及其應用。

背景技術

傳統的真核生物靶向基因操作是通過全能胚胎干細胞的同源重組和囊胚注射實現的。由于受到建立全能胚胎干細胞這一限制，主要是小鼠(也有大鼠的報道)可以通過全能胚胎干細胞的同源重組完成基因靶向改造[Capecchi,2005]。進行基因靶向操作的另一種途徑是克隆，即體細胞的基因改造和核移植。不過，克隆技術存在一些缺陷[Carter et al.,2002；Zhu et al.,2004]。比如，1、終末分化的體細胞克隆后很難完全去分化成未分化細胞，影響胚胎發育，造成發育缺陷；2、所有的遺傳物質僅為母源；3、成功率低等。傳統的基因靶向操作技術制約了基因敲除。

可編程核酸內切酶技術包括鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)技術和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs)技術，以及規律成簇間隔短回文重復系統(clustered regularly interspaced short palindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR/Cas9)[Kim and Kim,2014]。這類技術的發明和推廣打破了全能胚胎干細胞的限制，使得不同物種的基因操作變得可能。特別是CRISPR/Cas9系統，由于簡便、高效、價廉，出現之后立即席卷全球，成為了基因編輯領域最新，但發展最快、應用最廣的技術，引發了基因編輯領域的革命。現在CRISPR/Cas9系統已經被成功地用于DNA敲除、DNA敲入、DNA替代、DNA修飾、RNA修飾、DNA標記、基因轉錄調節等[Hsu et al.,2014；Komor et al.,2017]。并已經成功應用于多個物種的基因編輯[Barrangou R&Doudna JA,2016；Komor et al.,2017]。

CRISPR/Cas9介導特異性基因編輯是利用sgRNA(single guided RNA)通過靶序列互補引導Cas9蛋白定位剪切雙鏈DNA，造成雙鏈DNA斷裂(double-strand breaks,DSB)，在沒有模板的條件下，發生非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)修復，造成移碼突變(frameshift mutation)，導致基因敲除(knockout)；在有模板的條件下，通過同源重組進行修復(homology-directed repair,HDR)，實現基因敲入(knockin)[Hsu et al.,2014；Kim and Kim,2014；Komor et al.,2017]。由于HDR效率低(整合很少發生)，而且非同源性末端接合機制容易產生隨機插入和刪除(indel)，使得在斷裂點附近可能隨機引入新的堿基，從而導致不精確的基因編輯。此外，CRISPR/Cas9介導的基因編輯總有一些脫靶效應[Gorski et al.,2017]。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種高效精準的基因敲除策略。

最新研究表明，基于CRISPR/Cas9技術所構建的Cas9融合蛋白可作為“堿基編輯器(Base editor，BE)”。這些融合蛋白包含dCas9或Cas9切口酶以及大鼠胞苷脫氨酶APOBEC1，它通過脫氨基作用將胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶，而無需切割DNA。之后，通過DNA復制或修復，尿嘧啶被轉化成胸腺嘧啶(T)。類似地，其也能將單堿基G轉化成A。特別是Cas9切口酶與APOBEC1組成的BE3，其能夠將堿基編輯效率顯著提高到15～75％。由于不需切割DNA造成DSB，形成的indel低于1％，實現的基因編輯更精確[Komor et al.,2016]；而且，這種方式將脫靶效率降低到低于自然背景的10倍，實現的基因編輯更安全[Nishida et al.,2017]。BE3已經被成功地用于在體內堿基編輯，實現了小鼠的CT突變，效率達到44～57％[Kim et al.,2017]。

發明人基于上述BE介導單堿基突變，尤其是BE3介導的單堿基編輯的精確性和特異性，巧妙設計了一種基因敲除策略：通過CT突變引入終止密碼子，例如將CAA、CAG、CGA突變成終止密碼子TAA、TAG、TGA，或通過GA突變將TGG突變成終止密碼子TAA、TGA、TAG，終止編碼基因的翻譯，從而實現基因敲除。

根據本發明的第一方面，提供了一種基因敲除方法，其包括：