[發明專利]一種寡聚賴氨酸修飾的重組去鐵蛋白納米籠及其制備

在審

• 申請號: 201710435975.0
• 申請日: 2017-06-07
• 公開（公告）號: CN107286249A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 吳正紅;馬茁;袁世睿
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬生物醫藥技術領域，具體涉及一種寡聚賴氨酸修飾的重組去鐵蛋白納米籠及其制備方法。

背景技術

化學治療是常見的惡性腫瘤治療方法，但大多數抗腫瘤藥物因缺乏選擇性，在產生藥效的同時也會對機體產生嚴重的毒副作用。因此，抗腫瘤藥物靶向遞送系統的開發有著極其重要的臨床應用價值。去鐵蛋白作為一種天然蛋白質，不僅有著良好的生物相容性及穩定性，同時還能與腫瘤細胞表面高表達的轉鐵蛋白受體1(TfR1)發生特異性結合，并在該受體的介導作用下實現有效入胞，從而達到主動靶向的效果。去鐵蛋白通常由24個亞基自組裝而形成中空球形籠狀結構，粒徑為12-13nm。利用其對pH的敏感性，可通過改變溶液pH使蛋白籠發生解聚與復聚，從而進行藥物的包載；同時可通過基因工程、化學方法等多種手段對該蛋白的內外表面進行修飾，使得該蛋白能有效地構建新型多功能納米材料。這些優越的性能使得去鐵蛋白成為了一種理想的多功能納米藥物載體。

然而，未經修飾的去鐵蛋白納米籠在TfR1受體介導下，通過胞吞作用實現跨細胞轉運后，其通常會在溶酶體中停留，而溶酶體內存在的大量酶系會造成蛋白籠結構的破壞，從而導致其包載的藥物同樣暴露在溶酶體環境中發生降解及破壞，對需要在胞漿內特定細胞器或細胞核內發揮作用的藥物來說，需設計一種具有溶酶體逃逸功能的去鐵蛋白納米遞藥系統。賴氨酸作為一種堿性氨基酸，在溶酶體酸性條件下可發生質子化作用，引起氯離子和水大量進入溶酶體，導致溶酶體內滲透壓升高，最終破裂。故利用賴氨酸的這種“質子海綿效應”，利用基因工程重組表達技術在蛋白亞基的N端修飾不同數目的賴氨酸，以獲得表面修飾寡聚賴氨酸的重組去鐵蛋白籠，使其具備溶酶體逃逸性質。

發明內容

本發明的目的是為了克服天然人去鐵蛋白籠作為藥物遞送載體入胞后易被溶酶體降解的不足，而提供一種具有溶酶體逃逸功能的寡聚賴氨酸修飾的重組去鐵蛋白納米籠及其制備方法。該重組蛋白籠不僅可實現藥物至腫瘤細胞的靶向遞送，降低對機體正常組織的毒副作用，同時還能保護籠內的藥物不被溶酶體破壞，從而實現在胞漿內特定細胞器或細胞核內的遞送，達到更好的靶向治療效果。

為解決上述技術問題，本發明提供以下技術方案。

一種蛋白納米籠，通式為：n-Lys-HFn，其中，Lys表示賴氨酸，n為賴氨酸在單個蛋白亞基N端的修飾個數，n＝4、8，HFn指由24個人鐵蛋白H亞基(FTH)自組裝而形成的蛋白籠。

上述寡聚賴氨酸修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米籠，其制備方法主要包括以下步驟：

(1)重組蛋白籠表達工程菌的構建：以FTH編碼基因為基礎，在其5’端修飾不同數目的AAG或AAA(Lys的編碼基因)，并將得到的基因序列經雙酶切后亞克隆至pET-30a(+)質粒載體中，即得到待表達質粒模板。將該模板經熱休克法轉化至大腸桿菌感受態細胞，并通過Kanamycin抗性及基因測序等手段篩選出陽性單克隆，對陽性單克隆進行大量培養，并保存其甘油菌。

(2)融合蛋白的表達和收菌：將步驟(1)得到的陽性工程菌接種于LB-Kan+培養基中，培養至菌液OD₆₀₀達到0.3-0.5時，加入IPTG誘導表達，離心收集菌體。

(3)融合蛋白的分離純化：超聲破碎步驟(2)得到菌體，離心收集上清液，將上清置于水浴加熱后，再次離心獲得含有目的融合蛋白的上清液。將上清液上樣至Ni⁺柱，用梯度咪唑緩沖液先后洗脫雜蛋白和目的融合蛋白，收集洗脫液并進行SDS-PAGE分析，選擇含目的融合蛋白最多而雜蛋白最少的洗脫液，置于100kDa超濾管中離心脫鹽，得到純化后的目的融合蛋白。

(4)融合蛋白的腸激酶切：向步驟(3)得到的目的融合蛋白中加入重組腸激酶，作用于融合蛋白中的腸激酶位點，以切除組氨酸標簽，然后將反應產物置于100kDa超濾管中離心，最終得到所述目的蛋白(n-Lys-HFn)。

通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和透射電子顯微鏡(TEM)對產物進行表征。