[發(fā)明專利]浙江道地性白術(shù)的鑒定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710435641.3
• 申請日: 2017-06-11
• 公開（公告）號: CN107164494A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳紹寧;胡秀芳;梁宗鎖;呂洪飛;楊東風(fēng);賈巧君;丁先鋒;陳羽迪
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江理工大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司33212
• 代理人: 金祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用高分辨率熔解曲線技術(shù)鑒定浙白術(shù)道地性的方法。

背景技術(shù)

白術(shù)，屬菊科、蒼術(shù)屬多年生草本植物，以根莖入藥，具有多項藥用功能。主要分布于浙江、湖北、四川、云南、貴州等山區(qū)濕地。其拉丁學(xué)名Atractylodes macrocephala。屬于菊科、蒼術(shù)屬多年生草本植物。喜涼爽氣候，以根莖入藥，具有多項藥用功能。

浙江白術(shù)是著名的“浙八味”之一，四川、安徽、湖北等地也有栽培；白術(shù)存在多種形態(tài)結(jié)構(gòu)相似、特征相近的近緣種。再加之市場中藥材復(fù)雜混亂，存在大量代用品和混偽品，因此僅僅依靠主觀性強的傳統(tǒng)鑒別中藥材的方法難以精準(zhǔn)區(qū)分。

傳統(tǒng)鑒別中藥材的方法難以精準(zhǔn)區(qū)分白術(shù)與其混偽品。DNA條形碼技術(shù)在2003年被首次提出，并且迅速在物種的分類與鑒定研究領(lǐng)域中得到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。它是一種新型物種分子鑒定技術(shù)。該技術(shù)可以利用短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列片段作為物種標(biāo)記，定位親緣關(guān)系，分析分支來源，為中藥材提供快速、精準(zhǔn)的鑒定。它彌補了傳統(tǒng)鑒定方法的缺陷，并具有自身獨特的優(yōu)勢，例如準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好、操作簡便等。

由于核基因ITS2具有很強的物種水平鑒定能力和良好的PCR擴增效率，因此適合作為植物DNA條形碼的序列。ITS2區(qū)域可以潛在地用作標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼識別藥用植物及其近緣種，并且可以作為一個新的通用條碼來更廣泛地識別植物類群。

《白術(shù)和蒼術(shù)的鑒定研究》一文中研究采用ITS2序列對藥材白術(shù)與蒼術(shù)進行DNA條形碼鑒定。結(jié)果白術(shù)與蒼術(shù)的3個基原物種(蒼術(shù)、關(guān)蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù))ITS2序列均為229bp。13條白術(shù)的序列僅在98bp處有C-G變異，該方法告知ITS2序列在藥材白術(shù)與蒼術(shù)鑒定方具有很好的鑒別效果。

發(fā)明人在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，13種白術(shù)的序列在41bp和98bp處有C-G變異，83bp和187bp處有A-G變異，平均GC含量為69.42％；白術(shù)不同基原與其易混偽品的種間比對共有151個序列位點變異。從聚類分析的結(jié)果看，ITS2序列不能完全區(qū)分白術(shù)不同基原植物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速精準(zhǔn)鑒定道地性浙白術(shù)的檢測方法，本發(fā)明采用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)檢測ITS2序列，分析熔解曲線特征及差異能夠有效準(zhǔn)確地鑒定浙江白術(shù)道地性。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種快速精準(zhǔn)鑒定道地性浙白術(shù)的檢測方法，包括DNA提取，還包括以下內(nèi)容：

1)、PCR擴增

PCR擴增體系為：

擴增體系中所用的ITS2的引物序列：

引物F(ITS2-F)：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；

引物R(ITS3-R)：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。

PCR擴增程序為：

95℃變性5min；

95℃變性15s，Tm退火25s，72℃延伸30s；40個循環(huán)；引物退火溫度為55-59℃(最佳退火溫度為57℃)；

Green-2-Go Master mix，即為Green-2-Go qPCR Mastermix-Low ROX(2x)；

2)、40個循環(huán)后進入HRM程序，即，將擴增產(chǎn)物直接進行HRM。

HRM程序為：95℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃，1min；降溫至25℃；

收集65-95℃的熒光信號數(shù)據(jù)，獲得高分辨率熔解曲線；當(dāng)熔解曲線滿足Tm值92℃出現(xiàn)單峰曲線形狀時，判定是浙白術(shù)。

備注說明：熒光信號值是熒光定量PCR儀收集到的熒光信號經(jīng)過熒光定量PCR儀上的軟件分析獲得的一個相對值，實驗中有一個內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明所用數(shù)據(jù)分析方法為熔解溫度峰值法，依據(jù)Tm值分型，縱坐標(biāo)為熒光信號相對值對溫度的一階導(dǎo)數(shù)。

作為本發(fā)明技術(shù)方案的改進：所述步驟2)的高分辨率熔解曲線分析，是在Roche LightCyclerTM 480Ⅱ熒光定量PCR儀器上進行HRM；所用軟件為LightCycler 480Ⅱ分析軟件。當(dāng)熔解曲線滿足Tm值92℃出現(xiàn)單峰曲線形狀時，判定是浙白術(shù)，而安徽白術(shù)雙峰曲線出現(xiàn)在Tm值87℃。

作為本發(fā)明技術(shù)方案的改進：本發(fā)明利用磁珠法深加工產(chǎn)品基因組DNA抽提試劑盒提取白術(shù)藥材干粉的DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測及濃度測定。所得DNA濃度為26.45～112.42ng/ul。