[發明專利]S-2765凝血檢測發光底物的肝素含量的測定方法

在審

• 申請號: 201710433323.3
• 申請日: 2017-06-09
• 公開（公告）號: CN109030824A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 周勇
• 申請（專利權）人: 深圳標實科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種S?2765凝血檢測發光底物的肝素含量的測定方法，其包括待測樣品的處理、標準曲線的制作與樣品的測定三個部分。待測樣品的處理方法為稀釋與加熱處理，標準曲線的制作與樣品的測定采用微量發色底物法。本發明利用微量發色底物法進行測定，具有靈敏度高，操作簡單、省時，檢測所需試劑用量小等優點；通過60～80℃加熱處理待檢樣品抗凝血酶?Ⅲ濃縮物20～50min，能夠滅活待檢樣品中對結果造成很大影響的抗凝血酶?Ⅲ成分，但不會對肝素的活性產生影響，提高了測定結果的準確性；采用繪制標準曲線計算結果，穩定性、準確性高。

技術領域

本發明屬于生物學檢測技術領域，具體涉及一種S-2765凝血檢測發光底物的肝素含量 的測定方法。

背景技術

人抗凝血酶-Ⅲ(antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ)濃縮物是從人血漿中分離純化得到的血漿蛋 白制品，主要用于治療各種原因引起的抗凝血酶-Ⅲ缺乏癥及手術造成的血栓等。目前，抗凝 血酶-Ⅲ的純化制備工藝以利用肝素親和層析為主要步驟，在純化的過程中，會發生層析填料 中的肝素脫落，因此，要對抗凝血酶-Ⅲ濃縮物中的肝素含量進行檢測。歐洲藥典第7版 (European Pharmacopoeia 7.0，EP7.0)和美國藥典第32版(United StatesPharmacopeia 32， USP32)對抗凝血酶-Ⅲ濃縮物的要求為每國際單位(IU)抗凝血酶-Ⅲ中肝素含量不超過 0.1IU。

發色底物(chromogenic substrates)為化學合成的小肽，其一端為發色基團(pNA)。特 定的酶(如凝血酶)可將pNA催化解離下來。游離pNA可通過分光光度計或酶標儀檢測， 從而確定相應物質的活性。常見的發色底物有：凝血酶發色底物S-2238，FXa發色底物S-2765 和S-2222。發色底物法(chromogenic assays)是目前主要的肝素效價檢測方法，是歐洲藥典 (EP)和美國藥典(USP)中規定的肝素(特別是低分子肝素)檢測方法。該方法也廣泛用 于實驗室研究和體外診斷。通過控制反應體系的條件，發色底物法可檢測凝血因子、輔因子 或凝血因子抑制劑。

目前肝素的含量測定多采用凝固法和發色底物法，其檢測基本原理均基于肝素與抗凝血 酶-Ⅲ結合能夠滅活凝血因子或抑制凝血反應。

凝固法操作復雜、耗時，發色底物法具有靈敏度高，操作簡單、省時，檢測所需試劑用 量小等優點。在發色底物法中，繪制標準曲線計算結果的方式較采用的單一對比計算具有更 高的穩定性和準確性。由于待測樣品的特殊性，與肝素標準品相比，其含大量抗凝血酶-Ⅲ， 在測定反應中會促進對凝血因子的滅活反應，進而影響測定結果的準確性。

肝素含量測定法為凝固法，以血漿與高嶺土、腦磷脂混合物復鈣化后的凝固反應為檢測 體系，利用硫酸魚精蛋白能夠中和肝素從而影響檢測體系凝固時間為原理進行測定，但該方 法并不適用于抗凝血酶-Ⅲ濃縮物。截至目前，還沒有相關專門針對抗凝血酶-Ⅲ濃縮物中肝 素含量檢測方法的研究報道。

發明內容

本發明目的在于針對以上所述測定技術中存在的樣品抗凝血酶-Ⅲ的干擾大、測定準確性 不高等技術問題，提出一種新的S-2765凝血檢測發光底物的肝素含量的測定方法。首先根 據肝素具有比抗凝血酶-Ⅲ熱耐受性高的特點，設計采用高溫加熱處理的方法使待測樣品中抗 凝血酶-Ⅲ失活，進而消除其對測定結果的影響；其次，采用微量發色底物法，通過繪制標準 曲線，對待測樣品肝素含量進行計算。

本發明所采用的技術方案為：

一種S-2765凝血檢測發光底物的肝素含量的測定方法，其中，包括待測樣品的處理、 標準曲線的制作與樣品的測定三個部分；其操作步驟為：

A、待測樣品的處理：

用0.03mol/L Tris緩沖液將已知效價的抗凝血酶-Ⅲ濃縮物樣品稀釋至抗凝血酶-Ⅲ濃度為 1IU/ml，70～80℃高溫水浴處理30～50min；