[發(fā)明專利]髓核細(xì)胞源性活性微載體的構(gòu)建

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710432632.9
• 申請(qǐng)日: 2017-06-09
• 公開（公告）號(hào): CN107308497B
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周校澎;陶軼卿;李方財(cái);陳其昕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): A61L27/36
• 分類號(hào): A61L27/36;A61L27/38;A61L27/50;A61L27/54
• 代理公司: 33200 杭州求是專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 趙杭麗<國際申請(qǐng)>=<國際公布>=<進(jìn)入

本發(fā)明提供一種髓核細(xì)胞源性活性微載體構(gòu)建方法，將大鼠髓核細(xì)胞擴(kuò)增后利用離心法構(gòu)建出髓核細(xì)胞微球，在特定環(huán)境中培養(yǎng)12天，使髓核細(xì)胞分泌足夠的細(xì)胞外基質(zhì)成分，通過聯(lián)合使用脫細(xì)胞劑將細(xì)胞微球中原有的髓核細(xì)胞組分除去，從而獲得一種由髓核細(xì)胞自身分泌的基質(zhì)構(gòu)成的髓核細(xì)胞源性活性微載體。本發(fā)明得到具有高效誘導(dǎo)干細(xì)胞成髓核細(xì)胞定向分化的載體材料；獲得的細(xì)胞載體所含成分由髓核細(xì)胞自身合成，符合椎間盤原生態(tài)微環(huán)境；避免載體構(gòu)建過程中所引入的化學(xué)成分對(duì)載體生物活性的破壞，不含其他高分子材料，避免載體降解產(chǎn)物對(duì)椎間盤環(huán)境的影響，能搭載干細(xì)胞且能通過注射進(jìn)入生物體內(nèi)，可用于負(fù)載干細(xì)胞從而進(jìn)行退變椎間盤體內(nèi)修復(fù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物組織工程細(xì)胞載體材料，涉及一種髓核細(xì)胞源性活性微載體的構(gòu)建方法，是一種新型細(xì)胞載體。

背景技術(shù)

椎間盤退行性病變是目前社會(huì)的常見病，但當(dāng)前卻無有效手段從病因上修復(fù)退變?；诮M織工程的椎間盤修復(fù)是目前治療椎間盤退變的新思路，適當(dāng)?shù)募?xì)胞載體搭載間充質(zhì)干細(xì)胞后，可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞分化，從而修復(fù)退變的椎間盤。目前細(xì)胞載體的研究處于瓶頸期，以高分子聚合物為原料的細(xì)胞載體在體內(nèi)椎間盤環(huán)境中的降解產(chǎn)物易加劇椎間盤的惡劣環(huán)境，不利于椎間盤修復(fù)。網(wǎng)狀或纖維網(wǎng)狀的生物大分子材料在植入體內(nèi)時(shí)需要有開放性切口，破壞了椎間盤天然密閉微環(huán)境，同樣缺陷明顯。凝膠狀的生物大分子材料雖然具有可注射特性，植入過程中避免了椎間盤結(jié)構(gòu)的破壞，但水凝膠的彈性模量遠(yuǎn)低于天然椎間盤，無法為搭載于其中的干細(xì)胞提供原生態(tài)微環(huán)境，導(dǎo)致干細(xì)胞定向分化能力減弱，不利于退變椎間盤的修復(fù)。而為了優(yōu)化材料的理化特性，往往需要加入許多化學(xué)試劑，容易導(dǎo)致生物材料活性的降低，影響最后載體的促干細(xì)胞分化的效果。在椎間盤的主要結(jié)構(gòu)髓核中，主要細(xì)胞成分為髓核細(xì)胞，其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分構(gòu)成了正常髓核環(huán)境，利用髓核細(xì)胞這一特性，可一改原先通過物理或化學(xué)方法構(gòu)建細(xì)胞載體的傳統(tǒng)思路，通過生物的方法在體外構(gòu)建出一種髓核細(xì)胞源性的具有生物活性的原生態(tài)干細(xì)胞載體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種髓核細(xì)胞源性活性微載體構(gòu)建方法，是一種為了得到能搭載干細(xì)胞且能通過注射進(jìn)入生物體內(nèi)的細(xì)胞載體，該載體是用于負(fù)載干細(xì)胞從而進(jìn)行退變椎間盤體內(nèi)修復(fù)的。

本發(fā)明提供的細(xì)胞載體利用髓核細(xì)胞自身分泌能力構(gòu)建，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：首先從大鼠體內(nèi)獲得髓核細(xì)胞，體外擴(kuò)增至一定數(shù)量后利用離心法構(gòu)建出髓核細(xì)胞微球，在含有特定的生長因子的環(huán)境中培養(yǎng)12天，使髓核細(xì)胞分泌足夠的細(xì)胞外基質(zhì)成分。通過聯(lián)合使用脫細(xì)胞劑將細(xì)胞微球中原有的髓核細(xì)胞組分除去，從而獲得一種由髓核細(xì)胞自身分泌的基質(zhì)構(gòu)成的髓核細(xì)胞源性活性微載體。

具體構(gòu)建方法如下：

(1)髓核細(xì)胞微球制備

取SD大鼠髓核細(xì)胞，體外使用F12培養(yǎng)基擴(kuò)增至第3代，取4×10^{^5}個(gè)髓核細(xì)胞使用1mL F12培養(yǎng)基(含3151mg/L D-葡萄糖，365mg/L L-谷氨酰胺，55mg/L丙酮酸鈉，2438mg/L碳酸氫鈉，100U/mL青霉素，100ug/mL鏈霉素，pH 7.0-7.4)重懸，并置于15mL離心管，通過離心富集法在1000rpm下離心5分鐘，在F12培養(yǎng)基中靜置24h，利用髓核細(xì)胞自卷曲能力獲得髓核細(xì)胞微球；

(2)髓核細(xì)胞微球基質(zhì)合成

更換髓核細(xì)胞微球的培養(yǎng)環(huán)境：DMEM高糖培養(yǎng)基(含4500mg/L D-葡萄糖，584mg/LL-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸鈉，1.5g/L碳酸氫鈉，100U/mL青霉素，100ug/mL鏈霉素，pH7.0-7.2)中添加特定生長因子(10ng/mL的TGF-β3，10％胎牛血清，50nM維生素C)，于37℃，5％CO₂的環(huán)境中培養(yǎng)12天，每3天換一次液，促進(jìn)髓核細(xì)胞微球中基質(zhì)產(chǎn)生和沉積；(3)獲得髓核細(xì)胞源性活性微載體