[發(fā)明專利]一種β-甘露聚糖酶工程菌的篩選方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710432097.7
• 申請日: 2017-06-09
• 公開（公告）號: CN107129958B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發(fā)明（設計）人: 李爽;樊吳迪
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12Q1/34;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產(chǎn)權代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

本發(fā)明公開了一種β?甘露聚糖酶工程菌的篩選方法，包括如下步驟：(1)將β?甘露聚糖酶的表達菌在含有臺酚藍的KT平板上培養(yǎng)，直至平板上產(chǎn)生水解圈；(2)測量水解圈直徑與微生物菌落直徑，以二者大小的比值作為β?甘露聚糖酶的酶活指數(shù)，該指數(shù)與酶活正相關。本發(fā)明無需對工程菌裂解，即可實現(xiàn)胞內β?甘露聚糖酶酶活的快速檢測。所需步驟簡單，耗時短，成本低廉，且利于高通量篩選。

技術領域

本發(fā)明涉及一種β-甘露聚糖酶突變體的原位快速半定量篩選方法，屬于生物工程領域。

背景技術

β-甘露聚糖酶(β-mannanase,EC 3.2.1.78)屬于半纖維素酶，可以在β-1,4-D-甘露聚糖分子的主鏈內部隨機切割β-1,4-D-甘露糖苷鍵，從而產(chǎn)生不同長度的低聚甘露糖。低聚甘露糖作為添加劑在動物飼料行業(yè)有廣泛的應用，也是膳食纖維的重要成分，此外在造紙、紡織業(yè)、醫(yī)學、藥學、食品及石油開采等領域也具有重要的應用價值。

大腸桿菌表達β-甘露聚糖酶具表達量高、培養(yǎng)周期短、成本低等優(yōu)勢。但由于重組的β-甘露聚糖酶多為胞內表達，而底物甘露聚糖屬于大分子化合物，無法自由進出大腸桿菌細胞壁，酶活的檢測通常需要對細胞進行繁瑣、耗時、耗能的破壁處理。特別的，當對β-甘露聚糖酶引入隨機突變，而這種突變庫通常達到10³以上數(shù)量級，對每個突變體逐一進行細胞破壁、重組酶純化、酶活檢測，檢測周期以及人力、物力需要都非常巨大，無法高效的實現(xiàn)突變體庫的大規(guī)模篩選。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種基于大腸桿菌重組表達β-甘露聚糖酶酶活的半定量篩選方法，該方法無需細胞破壁、蛋白純化，且可以批量處理，大大縮短了突變體的初篩時間，提高了效率，且操作簡便、快速，成本低廉，有利于β-甘露聚糖酶突變體庫的高效篩選獲得候選突變體。

為實現(xiàn)發(fā)明目的采用如下技術方案：

一種β-甘露聚糖酶工程菌的篩選方法，包括如下步驟：

(1)將β-甘露聚糖酶的表達菌在含有臺酚藍的KT平板上培養(yǎng)，直至平板上產(chǎn)生水解圈；

(2)測量水解圈直徑與微生物菌落直徑，以二者大小的比值作為β-甘露聚糖酶的酶活指數(shù)(EI)，該指數(shù)與酶活正相關。

步驟(1)所述的培養(yǎng)包括三個階段：第一階段為37±2℃保溫6-12h；第二階段為25±2℃保溫1-3h；第三階段為30-60℃保溫8-20h。

所述第一階段為37℃保溫10h。

所述第二階段為25℃保溫2h。

所述第三階段的溫度為37℃～50℃。

所述第三階段的保溫時間為12h。

所述KT平板的原料組分為：1-2％蛋白胨、0.5-1％酵母提取物、1％氯化鈉、1-3％瓊脂和0.3-1％魔芋膠溶液。

所述KT平板的配制：將上述原料混合后115℃條件下高壓滅菌20min，冷卻后加入預先配制好的1％臺酚藍溶液至終濃度為0.02-0.05％。

所述β-甘露聚糖酶表達菌，其宿主菌為E.coli BL21(DE3)或E.coli BL21。

所述β-甘露聚糖酶表達菌，其表達載體為pET30(a)。

本發(fā)明的基本原理是臺酚藍可結合甘露聚糖將其染成藍色，而β-甘露聚糖酶具有降解甘露聚糖的能力，從而在KT平板上產(chǎn)生透明水解圈，且透明圈直徑/微生物菌落直徑的比值(EI值)與酶活力正相關。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：