[發明專利]美洲大蠊特異性COI引物、含有其的試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201710426033.6
• 申請日: 2017-06-08
• 公開（公告）號: CN107177680B
• 公開（公告）日: 2019-02-05
• 發明（設計）人: 姜順日;耿福能;劉彬;吳桃清
• 申請（專利權）人: 四川好醫生攀西藥業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于生物技術領域，具體提供了美洲大蠊特異性COI引物、含有其的試劑盒及應用。本發明根據美洲大蠊mtDNA的保守序列，設計了一對美洲大蠊特異性COI引物JmF1和JmR1(如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，經檢測，該引物僅對美洲大蠊具有特異性擴增能力，擴增產物大小為452bp，靈敏度DNA濃度檢出限為0.390625ng/uL。本發明利用PCR檢測技術，由特異性引物擴增得到特異性單一條帶，操作簡單，具有高效、價廉、特異性強的特點，提高了檢測的準確性。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體地說，涉及美洲大蠊特異性COI引物、含有其的試劑盒及應用。

背景技術

美洲大蠊(Periplaneta Americana L.)為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，是我國重要的傳統藥材。其入藥始載于《神農本草經》，并把它列為中品，謂“味咸、寒，有毒，治：血瘀癥堅寒熱、破積聚、喉咽閉、內寒無子”。《本草綱目》上記載其主治“瘀血，癥堅，寒熱，下氣，利血脈”。《中國藥學大辭典》、《中藥大辭典》、《中國藥用動物志》、《全國中草藥匯編》等近、現代藥學專著均記載蜚蠊有“活血、散瘀、化積、消疳、解毒、利尿、消腫”等功能。現代藥理研究表明美洲大蠊具有多種藥理作用，比如抗腫瘤、改善微循環、提高免疫力和促進組織修復等作用。

對美洲大蠊品種的鑒定是入藥的基礎，目前對藥用美洲大蠊的鑒定大多采用的是活體鑒別的方法，主要是依據其外部形態特征進行判斷。但是由于昆蟲類藥材大多外部形態相似，組織特征無特異性，而且經過產地粗加工和飲片炮制后，難以看出物種本身的形態和顏色，給準確的藥材鑒定帶來許多困難，所以傳統的形態學特征識別方法存在識別困難與識別錯誤的問題。因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補傳統分類方法的缺陷。

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術具有靈敏度高、特異性強、高速快速等特點，再加上特異性引物可擴增得到物種特異性的條帶，用此檢測方法可不受形態的控制。本發明即提供了一種高效便捷的分子檢測方法，利用特異性引物，根據預期DNA條帶的有無來鑒定美洲大蠊，為準確、快速鑒定美洲大蠊藥材提供有效手段支撐。

發明內容

本發明的目的是提供美洲大蠊特異性COI引物、含有其的試劑盒及應用。

為了實現本發明目的，本發明根據美洲大蠊的線粒體DNA序列，設計篩選得到一對美洲大蠊特異性COI引物，其包括：

正向引物JmF1：5’-TGCTGAGCTCGGGCAACCA-3’；

反向引物JmR1：5’-CTACTGATCATACGAAAAGGGGA-3’。

本發明還提供含有引物JmF1和JmR1的用于檢測美洲大蠊的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液中的至少一種。優先地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。

本發明還提供含有引物JmF1和JmR1，以及含有引物JmF1和JmR1的試劑盒在檢測美洲大蠊中的應用。

本發明還提供一種美洲大蠊的特異性快速PCR檢測方法，包括以下步驟：

1)供試品前處理；

2)提取樣品DNA；

3)以步驟2)提取的DNA為模板，利用權利要求1所述的引物JmF1和 JmR1進行PCR擴增反應；

4)分析PCR產物。

PCR擴增反應體系以25ul計為：10×PCR緩沖液(含Mg²⁺)2.0ul、10× dNTPs 2.0ul、Taq酶(5單位/ul)0.2ul、模板DNA 2.0ul、正，反向引物(5umol/L) 各1.0ul、無菌雙蒸水16.8ul。