[發明專利]一種利于蘋果愈傷的蘋果MdARF5基因及其應用

在審

• 申請號: 201710425692.8
• 申請日: 2017-06-08
• 公開（公告）號: CN107164386A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 王小非;郝玉金;安建平
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司11212
• 代理人: 楊立,王博

技術領域

本發明涉及一種利于蘋果愈傷的蘋果MdARF5基因及其應用，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

鋁離子對植物具有毒害作用，是植物生長的主要限制因子。鋁脅迫下植物通過根分泌有機酸螯合根際活性鋁是其一種抗鋁離子脅迫的主要方式。近幾十年來，我國蘋果產業中由于過量施氮，導致土壤酸化，在酸性土壤中,鋁離子被活化，易被植物吸收利用，從而抑制了果樹的生長發育，降低了園藝產品食用的安全性。因此，亟待研究植物提高鋁離子脅迫抗性的機理，對于果樹的抗性和品質起到關鍵作用。

最近研究表明，H⁺-ATP酶活性提高有助于有機酸的外泌，進而抑制鋁離子的吸收，AHAs屬于一類H⁺-ATP酶，它們在有機酸分泌和鋁離子抗性方面起到重要作用，前期研究也發現，生長素信號在調控有機酸外泌上也發揮重要作用，但是其機理不清楚。我們在研究過程中克隆了蘋果MdARF5基因，研究表明了MdMIEL1響應多種激素信號和脅迫響應，過量表達MdMIEL1提高了轉基因蘋果愈傷和轉基因擬南芥的抗鹽和抗旱能力。我們的研究發現，蘋果MdARF5能夠促進AHA基因表達，提高H⁺-ATPase活性，進而增加了根系中有機酸的外泌，最終提高蘋果愈傷對鋁離子脅迫的抗性。

發明內容

本發明首次通過植物基因工程技術改善植物抗鹽、抗旱性和其他有益生產性狀，從蘋果組培苗中分離克隆出的抗逆相關基因完整編碼區段的DNA片段，并驗證了該基因的功能，利用其功能最終發現采用超量表達之后轉基因植株抗鹽和抗干旱能力明顯提高。

本發明的目的之一，是提供一種利于蘋果愈傷的蘋果MdARF5基因。本發明的申請人從蘋果中分離克隆出的抗鹽相關基因完整編碼區段的DNA片段，并命名為MdARF5。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種利于蘋果愈傷的蘋果MdARF5基因，所述MdARF5基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，所述MdARF5基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本發明的目的之二，是提供上述利于蘋果愈傷的蘋果MdARF5基因的操作方法。本操作方法的技術流程成熟，適合產業化應用。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種利于蘋果愈傷的蘋果MdARF5基因的操作方法，包括以下步驟：

(1)提取蘋果組培葉片中的RNA及反轉錄；

(2)cDNA全長序列的獲得：根據NCBI查到的蘋果愈傷中MIEL1基因保守氨基酸序列，設計兼并引物MdARF5-F、MdARF5-R，然后以反轉錄合成的蘋果基因組cDNA為模板進行PCR擴增，得到cDNA全長序列；其中，MdARF5-F序列如SEQ.ID.NO.3所示，MdARF5-R序列如SEQ.ID.NO.4所示；

(3)PCR產物進行回收、載體連接、轉化、測序，即得到所述蘋果MdARF5基因。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，步驟(2)中，所述PCR擴增的反應體系為：

PCR反應程序為94℃預變性5min；循環參數為94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸90s，進行32個循環；72℃充分延伸10min。

本發明的目的之三，是提供上述利于蘋果愈傷的蘋果MdARF5基因在轉基因蘋果愈傷中的應用。本發明的申請人利用強啟動子(花椰菜花葉病毒35S啟動子)驅動原理的轉基因技術，將MdARF5基因的超量表達載體轉入蘋果愈傷中，從而獲得轉基因植株。實驗證明，超量表達MdARF5基因的轉基因蘋果愈傷在鹽和干旱脅迫下，死亡率相比于野生型明顯降低，說明MdARF5基因在植株抗逆中發揮重要作用。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種如上所述的利于蘋果愈傷的蘋果MdARF5基因在轉基因蘋果愈傷中的應用。

本發明的有益效果是：

1.本發明首次通過植物基因工程技術改善植物抗鹽、抗旱性和其它有益生產性狀，從蘋果組培苗中分離克隆出的抗逆相關基因完整編碼區段的DNA片段，并驗證了該基因的功能，利用其功能最終發現采用超量表達之后轉基因植株抗鹽和抗干旱能力明顯提高。

2.本發明的利于蘋果愈傷的蘋果MdARF5基因的操作方法的技術流程成熟，適合產業化應用。

3.本發明的利于蘋果愈傷的蘋果MdARF5基因可以應用在轉基因蘋果愈傷中，MdARF5基因在植株抗逆中發揮重要作用。