[發明專利]一種核酸雜交化學發光檢測方法

在審

• 申請號: 201710424227.2
• 申請日: 2017-06-07
• 公開（公告）號: CN107058584A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 黃寶福;章喜超;章曉媛;葉德;王哲
• 申請（專利權）人: 浙江殷欣生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 嘉興永航專利代理事務所(普通合伙)33265
• 代理人: 侯蘭玉

技術領域

本發明涉及一種核酸檢測方法，特別涉及一種核酸雜交化學發光檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術

目前主流的核酸檢測技術有基因測序、基因芯片、聚合酶鏈式反應等，以及基于非靶標物質擴增的技術，例如基于抗體捕獲的第二代雜交捕獲技術(德國凱杰公司的HC2)，基于RNA逆轉錄的核酸序列擴增技術(美國豪洛捷)，基于支鏈DNA信號放大的快速捕獲雜交技術(科蒂亞生物)等。但目前的各種方法均存在各種不足，如基因測序成本居高不下，基因芯片操作復雜、檢測靈敏度低，聚合酶鏈式反應對實驗室要求高等。

發明內容

本發明的目的在于提供一種核酸雜交化學發光檢測方法，該方法可以快速捕獲雜交目標核酸。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種核酸雜交化學發光檢測方法，該方法包括如下步驟：

(1)根據檢測的目標核酸的序列設計捕獲核酸序列和信號核酸序列，其中捕獲核酸序列5’端進行氨基修飾，信號核酸序列5’標記生物素；

(2)將捕獲核酸序列固定到基質上；

(3)通過核酸雜交反應，捕獲核酸序列和目標核酸結合；

(4)通過核酸雜交反應，標記了生物素的信號核酸序列和結合在捕獲核酸序列上的目標核酸結合；

(5)通過生物素-親和素的特異性結合反應，把標記了鏈霉親和素的微球結合到信號核酸序列上；

(6)通過生物素-親和素的特異性結合反應，生物素-堿性磷酸酶和微球上的鏈霉親和素結合；

(7)通過上述反應固定到基質上的生物素-堿性磷酸酶和發光底物反應，通過化學發光分析儀讀取結果，根據檢測值和空白對照值的差異來判斷待測的樣本中是否含有目標核酸。一般來講，檢測值和空白對照值具有顯著差異，可以認為待測的樣本中含有目標核酸。經過發明人多次試驗摸索，檢測值和空白對照值的比值大于1.5時，可以認為待測的樣本中含有目標核酸；否則待測的樣本中不含有目標核酸。

本發明建立了一種新的核酸物質檢測方法，通過該方法的建立擴大核酸檢測產品在醫療、科研、食品安全等領域的使用范圍。本發明方法通過基質、捕獲核酸序列、目標核酸、標記生物素的信號核酸序列、標記鏈霉親和素的微球和生物素-堿性磷酸酶、發光底物等對目標核酸進行特異性檢測。

作為優選，所述的微球是聚苯乙烯(PS)、交聯聚苯乙烯/聚二乙烯基苯(P[S/DVB])或聚甲基丙烯酸酯(PMMA)微球，微球的直徑為50-500nm。本發明采用的微球是表面聚合鏈霉親和素的微球。

作為優選，所述捕獲核酸序列和目標核酸的特定片段互補，且長度在15-50個堿基。

作為優選，所述信號核酸序列和目標核酸的特定片段互補，且長度在15-50個堿基。

作為優選，所述基質是微孔板、微球、玻片、硅片或微流體芯片。

作為優選，當基質是氨基修飾的微孔板則通過戊二醛固定，當基質是羧基修飾的微球時，通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺固定。

作為優選，捕獲核酸序列和信號核酸序列分別針對目標核酸的不同片段。

作為優選，所述發光底物是C₁₈H₂₁Na₂O₇P(AMPPD)、C₁₈H₂₀ClNa₂O₇P(CSPD)、C₁₈H₂₀ClNa₂O₇P(ADP-Star)或C₁₈H₁₉Cl₂O₇Na₂P(CDP-Star)。

本發明的有益效果是：本發明通過捕獲核酸序列將目標核酸雜交捕獲，再經過信號核酸序列、微球、生物素-親和素以及堿性磷酸酶的活性即可實現信號放大，從而檢測到目標核酸的信號。相對于PCR技術需要擴增，本發明在不增加檢測物濃度的前提下實現目標核酸的檢測，且具有穩定性好，成本低，檢測速度快，對環境要求低等優點。

附圖說明

圖1是本發明方法的作用機理示意圖；

圖中：1基質、2捕獲核酸序列、3目標核酸、41生物素、42信號核酸序列、51微球、52鏈霉親和素、61生物素-堿性磷酸酶。

具體實施方式