[發明專利]聚酰胺?胺樹狀大分子與納米金顆粒的復合物作為非病毒載體進行基因轉染的應用方法

在審

• 申請號: 201710422901.3
• 申請日: 2017-06-07
• 公開（公告）號: CN107142281A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發明（設計）人: 曹雪雁;史向陽;徐琲;李愛軍;郝欣欣
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C08G73/02
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司31001
• 代理人: 翁若瑩,王文穎

技術領域

本發明涉及一種聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復合物作為非病毒載體進行基因轉染的應用方法，特別涉及一種聚乙二醇和葉酸修飾的聚酰胺-胺樹狀大分子包裹納米金顆粒作為非病毒載體進行基因轉染及免疫安全性研究的應用方法，屬于功能化高分子納米材料基因轉染載體技術領域。

背景技術

基因治療是指通過基因水平的操作而達到治療或預防疾病的方法。目前，基因治療主要是針對嚴重威脅人類健康的疾病進行治療，癌癥是其主要應用領域。基因治療技術如今發展迅速，部分基因治療方案已經進入臨床試驗階段。在臨床試驗時，發現了很多安全隱患，比如其安全性、靶向性、轉移效率較低等問題尚未解決。

目前，在基因載體系統中主要分為兩部分，病毒載體系統和非病毒載體系統。病毒載體由于其高效的轉染效率從而應用于臨床上的基因治療。但是由于其體積小，所以運載基因的數量有限，而且容易產生基因突變和免疫原性。然而，非病毒載體的生物安全性好，免疫原性低。其與脂質體、多聚物和DNA復合物等產品的相繼出現，促使非病毒載體在基因治療中的廣泛應用。

非病毒載體系統中，樹狀大分子能作為一種理想的納米材料應用于基因傳遞系統。其區別于傳統的線性聚合物類納米材料，具有獨特的高度支化三維立體結構，有良好的單分散性。樹狀大分子經過各種表面化修飾，如聚乙二醇化、乙酰化和烷基化等，產生了不同的理化性質。研究表明，第五代樹狀大分子有一定的細胞毒性，但是與納米金顆粒形成復合物[Shan Y.，Luo T.，Peng C.，et al.，Gene delivery using dendrimer-entrapped gold nanoparticles as nonviral vectors[J]. Biomaterials，2012，33(10)：p.3025-3035.]會降低載體的毒性。Xiao等[Xiao T.，Hou W.，Cao X.，et al.，Dendrimer-entrapped gold nanoparticles modified with folic acid for targeted gene delivery applications.Biomaterials Science，2013，1(11)：p.1172.]將葉酸修飾到第五代樹狀大分子(PAMAM)表面，與基因在特定比例下產生了更高的基因轉染效率。

從分子生物學角度分析基因轉染的免疫安全性，其中實時熒光定量反轉錄 PCR技術是基因轉錄水平上檢測基因表達量的重要檢測手段，在生物醫學領域應用廣泛。實時熒光定量反轉錄PCR技術一般采用2^-△△Ct法，計算實驗組與對照組中基因的相對表達量。公式是△△Ct＝(Ct目的基因-Ct對照基因)實驗組-(Ct 目的基因-Ct對照基因)對照組，Ct值是熒光信號達到閾值時的體系循環數目。

檢索國內外相關文獻和專利結果表明：聚乙二醇和葉酸共同修飾聚酰胺-胺樹狀大分子包裹納米金顆粒作為基因載體進行基因轉染，運用實時熒光定量反轉錄PCR技術對基因轉染后的免疫安全性檢測尚未見報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復合物作為非病毒載體進行基因轉染的應用方法，得到的復合物能具有良好生物相容性、細胞免疫安全性以及高效基因轉染效率，在惡性腫瘤的基因治療等方面有較好的應用前景。

為了解決上述問題，本發明提供了一種聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復合物作為非病毒載體進行基因轉染的應用方法，其特征在于，所述樹狀大分子的表面是氨基末端，對其進行化學修飾可降低其毒性并提高轉染效率；其末端連接靶向基團包括葉酸，RGD，透明質酸，能高效地進行基因傳遞。

優選地，所述化學修飾的方法為修飾聚乙二醇、修飾環糊精、乙酰化和烷基化的方法中的任意一種或幾種。

優選地，所述復合物中Au與G5.NH₂摩爾比為25∶1及以上。

更優選地，所述復合物中Au與G5.NH₂摩爾比為25∶1、50∶1、75∶1或100∶1。

優選地，所述復合物在基因轉染體系中的濃度為1.0～2.0mg/mL。

優選地，所述基因傳遞的傳遞外源治療基因包括pDNA，CpG DNA，反義核苷酸，siRNA及ssDNA中的任意一種或幾種。

更優選地，所述基因傳遞的外源治療基因的目標細胞包括癌細胞及體細胞。