[發明專利]一種檢測食管鱗癌相關基因TFPI2和HSPB2啟動子甲基化程度的試劑盒

在審

• 申請號: 201710422533.2
• 申請日: 2017-06-07
• 公開（公告）號: CN107177679A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發明（設計）人: 顧春雨;程志斌;郭輝
• 申請（專利權）人: 北京呈諾醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京衛平智業專利代理事務所(普通合伙)11392
• 代理人: 董琪

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種檢測食管鱗癌相關基因 TFPI2和HSPB2啟動子甲基化程度的試劑盒。

背景技術

食管癌(esophageal carcinoma，EC)是常見惡性腫瘤之一，其發病率在全球和中國分別排名第八和第四，全球每年有超過48萬新發病例，造成約40萬人死亡，其中一半發生在中國。目前食管癌治療方法十分有限，5年生存率為15-25％(Chen,Zheng et al.2016)。食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是亞洲最主要的食管癌類型(約90％)，全球約70％的ESCC病例發生在中國。ESCC 的發病機理目前尚不明確，吸煙、飲酒、飲食習慣和家族病史等被認為是最重要的影響因素，研究數據表明這些影響因素有明顯的地域性差異，其中飲食習慣和家族病史對中國人的影響更大(Chen,Zheng et al.2016)。

目前對食管鱗癌的診斷仍局限在晚期階段，且缺乏有效的早期診斷手段。近年來，隨著分子診斷技術的進步，尤其是分子診斷技術在液體活檢方面的廣泛應用，大腸癌、肺癌、乳腺癌等多種癌癥的早期篩查技術取得了重大進展。現有分子檢測對象多集中于基因突變，即基因序列或拷貝數變異，然而這類突變通常發生在較大的序列范圍內，給檢測工作帶來諸多困難(Warton and Samimi 2015)。相比之下，以基因啟動子異常甲基化作為腫瘤標志物具有獨特優勢，這類甲基化限定在啟動子CpG島中，檢測范圍較小，并且具有腫瘤特異性，能夠在發病早期就被檢測到，因此具有巨大的開發價值。目前，基于檢測SEPT9啟動子甲基化程度的商業化大腸癌檢測試劑盒已獲美國 FDA批準應用于臨床，但食管鱗癌相關基因甲基化檢測領域尚無相應產品問世。

目前，已有多個研究機構發表食管鱗癌甲基化檢測靶標基因的相關報道，這些靶標基因包括TFPI2(tissue factor pathway inhibitor) 和HSPB2(heat shock protein B2)。TFPI2在多種腫瘤中表達下調，是一個潛在的抑癌基因，研究表明TFPI2啟動子的特定CpG位點在早期食管鱗癌中的甲基化頻率為67％，并且與腫瘤進展正相關(Jia, Yang et al.2012)。HSPB2是熱激蛋白家族成員，它在早期食管鱗癌中的甲基化頻率為95.7％(Chang,Yamashita et al.2011)。這些都為食管鱗癌輔助檢測提供了理論基礎，但目前國內外尚無TFPI2和HSPB2 啟動子甲基化檢測試劑盒及其在食管鱗癌輔助檢測方面的報道。

發明內容

本發明旨在填補食管鱗癌相關基因甲基化檢測試劑盒的空白，提供一種靈敏度高、特異性好、準確率高和操作簡單的可用于檢測食管鱗癌相關基因TFPI2和HSPB2啟動子甲基化程度的檢測試劑盒，這兩種基因啟動子特定CpG位點的甲基化頻率與食管鱗癌的患病率呈正相關，可以通過此檢測輔助診斷食管鱗癌。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：

一種可用于檢測食管鱗癌相關基因TFPI2和HSPB2啟動子甲基化程度的試劑盒，包括TFPI2和HSPB2基因啟動子CpG位點的甲基化特異性擴增正向引物、反向引物及其非甲基化特異性擴增正向引物和反向引物，其中所述的TFPI2基因啟動子CpG位點的甲基化特異性擴增正向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-CGGTCGGACGTTCGTTTCGTATAAAGC-3’(SEQ ID NO.1)；

所述的TFPI2基因啟動子CpG位點的甲基化特異性擴增反向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-GAACGACCCGCTAAACAAAACGT-3’(SEQ ID NO.2)；

所述的TFPI2基因啟動子CpG位點的非甲基化特異性擴增正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

5’-TTGGTTGGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3’(SEQ ID NO.3)；

所述的TFPI2基因啟動子CpG位點的非甲基化特異性擴增反向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-AAACAACCCACTAAACAAAACATC-3’(SEQ ID NO.4)。

所述的HSPB2基因啟動子CpG位點的甲基化特異性擴增正向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-CGTGTAAATCGTTTGTGAGGGTTTTAGC-3’(SEQ ID NO.5)；