[發明專利]一種穩定表達NS1蛋白細胞株的構建方法

在審

• 申請號: 201710421832.4
• 申請日: 2017-06-07
• 公開（公告）號: CN107190024A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 劉宏生;陳思瑤;朱俊豐;李雪
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司21207
• 代理人: 金春華

技術領域

本發明屬于醫學分子生物學領域。具體涉及一種穩定表達NS1蛋白(Non-Structural 1Protein,NS1)肺癌細胞株的構建方法。

背景技術

慢病毒(Lentivirus)載體是以I型人類免疫缺陷病毒為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息，需要利用表達載體和包裝質粒共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝。包裝好的病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液中包含高滴度的病毒顆粒，可以直接用于宿主細胞的感染。目的基因通過病毒感染進入到宿主細胞之后，整合到基因組，從而持續的高水平的表達目的基因。在細胞相關的實驗操作中，對于一些按常規方法難以轉染甚至無法轉染的細胞，通過慢病毒介導的轉染能夠大大提高基因的轉導效率，以達到目的基因的高效表達。

禽流感病毒是一種A型流感病毒，屬于正粘病毒科，流感病毒屬。A型流感病毒的基因組由8個節段的單股負鏈RNA構成，編碼11-12種蛋白，包括：HA、NA、M1、M2、NS1、NS2、NP、PB1、PB2、PA，以及NP40和PB1-F2。其中NS1蛋白(non-structural protein 1)由流感病毒第8個節段的RNA編碼，含202-237個氨基酸，相對分子量約為28kD，在不同病毒株之間有差異。最近的結構解析發現這主要是與其特異的構造有關，NS1蛋白由三部分組成：RNA結合結構域(RNA binding domain，RBD)、效應結構域(effector domain，ED)以及兩者的連接區域(linker region，LR)，靈活可變的連接區域可以使NS1蛋白呈現不同的構象，從而完成與不同RNA和蛋白的結合。NS1的RNA結合結構域(RBD)由73個氨基酸組成，能夠結合異源RNA，包括病毒基因組RNA、病毒mRNA的5’非翻譯區、poly(A)RNA和外源dsRNA；NS1的C末端效應結構域(ED)是NS1與宿主相互作用的主要結構域，具有阻斷宿主mRNA剪接、多聚腺苷酸化和核轉運等功能。

NS1蛋白與流感病毒的毒性密切相關，在調控流感病毒致病性方面發揮著重要的作用。A型流感病毒的NS1蛋白具有影響宿主細胞凋亡的作用。其影響宿主細胞凋亡的過程還沒有完全被闡述清楚，已有的研究發現NS1蛋白同時具有促進凋亡和抑制凋亡的雙重作用。在感染早期，NS1蛋白通過降低IFN的表達量以抑制IFN的下游反應，從而抑制宿主細胞凋亡；同時，NS1也可以與PI3K相互作用，激活PI3K/AKt信號通路，從而抑制JNK依賴、Bax介導的宿主細胞凋亡。NS1還可以通過很多其他途徑影響細胞的凋亡。據報道，在病毒感染時，激活狀態的PKR對于凋亡有重要作用，而NS1蛋白可以直接結合并抑制PKR激活的促凋亡反應；NS1蛋白N端RNA結合區域可以與細胞內dsRNA結合，從而抑制起促凋亡作用的OAS/RNase L通路；有研究發現NS1可以抑制p53調控因子的活性，從而抑制p53調節的凋亡作用；NS1直接與hGBP1(Human guanylate-binding protein 1)相互作用，導致hGBP1的GTPase活性降低，間接抑制了凋亡反應。雖然凋亡過程經常被認為是宿主細胞自身為了限制病毒復制，而采取的一種抗病毒反應，但是在A型流感病毒感染細胞中凋亡過程的作用還不是很清楚。

發明內容

本發明的目的是利用重組慢病毒系統制備一種融合標簽蛋白并能穩定表達NS1蛋白的細胞株，該細胞株為研究NS1蛋白的生物學功能提供一個很好的工具。

本發明采用的技術方案是：一種穩定表達NS1蛋白細胞株的構建方法，包括如下步驟：

1)NS1基因的擴增；

2)將NS1基因與載體pLenti-CMV-EGFP-3Flag-PGK-Puro連接，構建重組慢病毒表達質粒pLenti-CMV-NS1-EGFP-3Flag-PGK-Puro；

3)將重組慢病毒表達質粒pLenti-CMV-NS1-EGFP-3Flag-PGK-Puro與病毒包裝質粒共轉染293T細胞，經培養、出毒、收取上清液，過濾，得包裝好的重組慢病毒CMV-GFP-L.V.；

4)將包裝好的重組慢病毒CMV-GFP-L.V.轉染A549細胞，通過嘌呤霉素篩選陽性細胞株，對陽性細胞株進行細胞免疫熒光及Western blot鑒定，獲得穩定表達NS1蛋白細胞株。