[發明專利]一種穩定表達NS1蛋白細胞株的構建方法在審
| 申請號： | 201710421832.4 | 申請日： | 2017-06-07 |
| 公開（公告）號： | CN107190024A | 公開（公告）日： | 2017-09-22 |
| 發明（設計）人： | 劉宏生;陳思瑤;朱俊豐;李雪 | 申請（專利權）人： | 遼寧大學 |
| 主分類號： | C12N15/867 | 分類號： | C12N15/867;C12N5/10 |
| 代理公司： | 沈陽杰克知識產權代理有限公司21207 | 代理人： | 金春華 |
| 地址： | 110000 遼寧*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 穩定 表達 ns1 蛋白 細胞株 構建 方法 | ||
1.一種穩定表達NS1蛋白細胞株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
1)NS1基因的擴增；
2)將NS1基因與載體pLenti-CMV-EGFP-3Flag-PGK-Puro連接，構建重組慢病毒表達質粒pLenti-CMV-NS1-EGFP-3Flag-PGK-Puro；
3)將重組慢病毒表達質粒pLenti-CMV-NS1-EGFP-3Flag-PGK-Puro與病毒包裝質粒共轉染293T細胞，經培養、出毒、收取上清液，過濾，得包裝好的重組慢病毒CMV-GFP-L.V.；
4)將包裝好的重組慢病毒CMV-GFP-L.V.轉染A549細胞，通過嘌呤霉素篩選陽性細胞株，對陽性細胞株進行細胞免疫熒光及Western blot鑒定，獲得穩定表達NS1蛋白細胞株。
2.根據權利要求1所述的一種穩定表達NS1蛋白細胞株的構建方法，其特征在于，所述的步驟1)，以NS1-F和NS1-R為特異性引物，添加酶切位點EcoR I，以質粒pEGFP-N1-NS1為模板，進行PCR擴增；所述的特異性引物NS1-F和NS1-R的序列為：
NS1-F:5'CCGGAATTCATGGATTCCAACACTGTGT 3'
NS1-R:5'CCGGAATTCCGAACTTTTGACTCAATTGT 3'。
3.根據權利要求2所述的一種穩定表達NS1蛋白細胞株的構建方法，其特征在于，PCR擴增體系為：
PCR反應程序：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，4℃保溫，30個循環。
4.根據權利要求1所述的一種穩定表達NS1蛋白細胞株的構建方法，其特征在于，步驟3)中，所述的病毒包裝質粒是pLP1、pLP2和pLP。
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