[發明專利]一種選擇性檢測海水中活的副溶血性弧菌的方法

有效

• 申請號: 201710421611.7
• 申請日: 2017-06-07
• 公開（公告）號: CN107177678B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 趙俊;曲克明;張旭志;單秀娟;李秋芬;張艷;丁東生;陳聚法;楊倩倩
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/63
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

一種選擇性檢測海水中活的副溶血性弧菌的方法，屬于微生物檢測領域，它的步驟包括膜過濾采集總菌、疊氮化鈉處理采集到的總菌和環介導等溫基因擴增測定；所述活的副溶血性弧菌包括可培養狀態和非可培養狀態。本發明采用價格低廉、易于獲得的疊氮化鈉預處理死菌中的DNA和胞外DNA，使它們失去擴增活性，進而通過基因擴增實現選擇性檢測活的副溶血性弧菌；操作過程中無需特定光源設備和其它貴重儀器，操作簡易，成本低。

技術領域

本發明屬于微生物檢測領域，具體涉及一種選擇性檢測海水中活的副溶血性弧菌(包括可培養狀態和非可培養狀態)的方法。

背景技術

副溶血性弧菌為革蘭氏陰性菌，具有嗜鹽、耐熱特征，主要存在于海洋、河口環境及魚、蝦、貝等生物體中，是沿海地區主要食源性病原菌之一。從人類健康安全的角度出發，對水產品污染的可能性進行準確判斷異常重要。到目前為止，多種分析檢測方法得到了研究與應用，比如傳統的培養法、免疫法，以及基于遺傳物質信息的分子生物學方法——生物傳感器法、聚合酶鏈式反應(PCR)法、環介導等溫基因擴增法等，近年來都得到了迅猛的發展。特別是基于環介導等溫基因擴增的各種方法(Yamazaki W,Yuko K,RyokoU,etal.Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid andsimpledetection of Vibrio parahaemolyticus in naturally contaminated seafoodsamples.Food Microbiology,2011,28,1238；Zeng J,Wei H,Zhang L,et al.Rapiddetection of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters using immunomagneticseparation combined with loop-mediated isothermal amplification.InternationalJournal of Food Microbiology,2014,174,123；Wang Y,Li DX,Wang Y,et al.Rapid andsensitive detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus bymultiple endonuclease restriction real-time loop-mediated isothermalamplification technique.Molecules,2016,21,111；Wang R,Xiao XN,Chen Y,et al.Aloop-mediated,isothermal amplification-basedmethod for visual detection ofVibrio parahaemolyticus within only 1h,from shrimp sampling toresults.Analytical Methods,2017,9,1695)，較之于PCR法具有更高的靈敏度(最低可以檢測出1個拷貝的基因)和特異性，而且生化反應對模板溶液中的血漿、細胞殘渣等干擾物質耐受能力強(Zhang X,Lowe SB,Gooding JJ.Brief review of monitoring methodsfor loop-mediated isothermalamplification(LAMP).BiosensorBioelectronics,2014,61,491)，是近期研究熱點之一。然而，大多基于環介導等溫基因擴增的檢測方法，只能用于診斷被檢測樣品中是否存在目標微生物標識基因，不能有效確定該基因是否來自于活性(包括可培養狀態和非可培養狀態)副溶血性弧菌。