[發明專利]一種選擇性檢測海水中活的副溶血性弧菌的方法

有效

• 申請號: 201710421611.7
• 申請日: 2017-06-07
• 公開（公告）號: CN107177678B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 趙俊;曲克明;張旭志;單秀娟;李秋芬;張艷;丁東生;陳聚法;楊倩倩
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/63
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種非診斷目的的選擇性檢測海水中活的副溶血性弧菌的方法，其特征在于它的步驟包括膜過濾采集總菌、疊氮化鈉處理采集到的總菌和環介導等溫基因擴增測定；所述活的副溶血性弧菌包括可培養狀態和非可培養狀態；

所述的膜過濾采集總菌的步驟，指原位收集待測定海水；采用孔徑為0.45μm的水系微孔濾膜過濾采集海水中總菌；

所述的疊氮化鈉處理采集到的總菌的步驟，指首先采用細胞釋放溶液將微孔濾膜上的總菌洗脫到容器里，加入疊氮化鈉溶液，自然光條件下反應20min，獲得總菌懸浮液。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的環介導等溫基因擴增測定的步驟，指以疊氮化鈉處理過的總菌懸浮液為生化擴增反應模板，然后加入包括引物、酶在內的擴增反應試劑和指示劑，封閉反應管，放入61-65℃下反應；同時做陽性和陰性對照，指示劑顏色變化指示環介導等溫基因擴增結果。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的指示劑為GeneFinder核酸染料。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的各步驟，均采用無菌的潔凈器具。

5.根據權利要求1所述的一種非診斷目的的選擇性檢測海水中活的副溶血性弧菌的方法，其特征在于它的具體步驟如下：

1)清洗、滅菌所有需要的器具，使用前密封保存；

2)用60mL一次性無菌注射器抽取海水樣品50mL，然后裝上直徑13mm、孔徑0.45μm水系微孔濾器，緩慢推出海水；

3)從濾器中取出濾膜放入5mL離心管，加入1mL細胞釋放溶液，手動震蕩1min，將濾膜上所得總菌洗脫到離心管內溶液中；

4)向上述離心管溶液中加入10μL10 mmol/L疊氮化鈉，搖勻，自然光下反應20min，獲得總菌懸浮液；

5)向0.2mL薄壁PCR管中加入環介導等溫基因擴增試劑，制得生化反應混合液；25μL的反應體系包括各1.6μmol/L的引物FIP和BIP，各0.8μmol/L的引物LF和LB，各0.2μmol/L的引物F3和B3，1.4mmol/L的dNTPs，6.0mmol/L的MgSO₄和1×緩沖液；其中引物針對副溶血性弧菌的tlh基因，序列分別為(5’-3’)：

F3：AGC TAC TCG AAA GAT GAT CC；

B3：GGT TGT ATG AGA AGC GAT TG；

FIP：ATGTTTTTA AATGAA ACGGAGCTCCGGCAAAAA ACG AAG ATG GT；

BIP：ACG TCG CAA AAC GTT ATC CGG CGA AGA ACG TAA TGT CTG；

LF：ACC AGT AGC CGT CAA TG；

LB：TTA GAT TTG GCG AAC GAG A；

6)取5μL模板溶液加入上述生化反應混合液中，不蓋PCR管蓋子，輕微振動混勻；隨后將反應管放入高于95℃的水中10min，取出后冷卻至室溫；

7)向PCR管內溶液中加入1μL Bst2.0 DNA聚合酶，不蓋PCR管蓋子，輕微振動混勻；

8)向PCR管蓋子內部均勻涂上1μL GeneFinder核酸染料，然后蓋上蓋子，并將PCR管置于64℃水浴中反應60min；

9)取出PCR管，上下顛倒幾次或者劇烈震蕩，使GeneFinder核酸染料混入環介導等溫基因擴增生化反應液；

10)結果判斷：自然光條件下，PCR管中反應后混合液如果顯示橙色，表明待測海水中不含副溶血性弧菌；顯示綠色，表明待測海水中含有活的副溶血性弧菌。