[發(fā)明專利]一種基于靶蛋白親和整體色譜柱分離細(xì)菌生物膜抑制成分的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710420900.5
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN107192778B
• 公開（公告）日: 2020-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭嘉亮;孫平華;梁應(yīng)池;江正瑾;林航;陳奕銳;黃若詩;劉連
• 申請（專利權(quán)）人: 郭嘉亮
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京前審知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11760
• 代理人: 張波濤;李鋒

1.一種利用LasR親和整體色譜柱分離鑒定細(xì)菌生物膜抑制成分的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)色譜柱的原位聚合，包括：將HEMA、EDMA、環(huán)己醇、正葵醇和AIBN混合溶液裝入1mL玻璃片中，超聲脫氣后注入石英毛細(xì)管內(nèi)，兩端以硅膠塞封口，60℃下反應(yīng)12h；聚合反應(yīng)結(jié)束后，依次用甲醇、水反復(fù)沖洗除去未反應(yīng)物、殘留溶劑、低聚產(chǎn)物，即制備獲得poly(HEMA-co-EDMA)整體色譜柱；

(2)受體蛋白LasR的原位固定化，包括：將步驟(1)的整體色譜柱活化引入活性伯氨基，將活化的整體色譜柱與受體蛋白衍生物反應(yīng)，所述受體蛋白衍生物包括受體蛋白的N-羥基琥珀酸亞胺酯衍生物；

(3)受體蛋白LasR親和整體色譜柱的性能評價；

(4)將含有細(xì)菌生物膜抑制活性的樣品過親和整體色譜柱；

(5)親和純化洗脫液中細(xì)菌生物膜抑制活性的檢測，用制備型HPLC對親和純化洗脫液中的細(xì)菌生物膜抑制組分進(jìn)行檢測和分離，收集化合物峰驗證其對細(xì)菌生物膜形成的抑制率；

所述細(xì)菌生物膜抑制成分是作用于生物膜相關(guān)的受體蛋白LasR的群體感應(yīng)抑制劑(QSI)。

2.如權(quán)利要求1所述利用LasR親和整體色譜柱分離鑒定細(xì)菌生物膜抑制成分的方法，其特征在于整體色譜柱活化的步驟包括：將整體色譜柱基質(zhì)中的羥基氧化為醛基、然后與二胺進(jìn)行縮合反應(yīng)，引入活性伯氨基；和/或

受體蛋白的N-羥基琥珀酸亞胺酯衍生物通過以下方法制備：將受體蛋白與碳二亞胺(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺反應(yīng)生成琥珀酰亞胺酯衍生物。

3.如權(quán)利要求1所述利用LasR親和整體色譜柱分離鑒定細(xì)菌生物膜抑制成分的方法，其特征在于步驟(3)所述性能評價包括群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白固定量的檢測、親和特異性評價；

所述群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白固定量檢測包括：根據(jù)步驟(2)中蠕動泵的流速和群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白蛋白溶液的濃度計算輸入至色譜柱的群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白總量；收集合并流出的洗脫液，通過考馬斯亮藍(lán)G250在595nm處的吸光值，計算流出色譜柱的群感系統(tǒng)中與生物膜相關(guān)的受體蛋白總量。

4.如權(quán)利要求1所述利用LasR親和整體色譜柱分離鑒定細(xì)菌生物膜抑制成分的方法，其特征在于所述步驟(4)包括：以植物提取物為樣品鑒定對細(xì)菌生物膜形成的抑制作用，所述植物提取物為廣金錢草的醇提取物。

5.如權(quán)利要求4所述利用LasR親和整體色譜柱分離鑒定細(xì)菌生物膜抑制成分的方法，其特征在于所述步驟(5)包括使用C18色譜柱，以1％甲酸溶液和甲醇溶液為流動相梯度洗脫，DAD檢測器274nm處檢測。