[發明專利]一種基于靶蛋白親和整體色譜柱分離細菌生物膜抑制成分的方法

有效

• 申請號: 201710420900.5
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN107192778B
• 公開（公告）日: 2020-03-03
• 發明（設計）人: 郭嘉亮;孫平華;梁應池;江正瑾;林航;陳奕銳;黃若詩;劉連
• 申請（專利權）人: 郭嘉亮
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京前審知識產權代理有限公司 11760
• 代理人: 張波濤;李鋒

一種細菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法，其包括：(1)色譜柱的原位聚合；(2)受體蛋白的原位固定化；(3)受體蛋白親和整體色譜柱的性能評價；(4)將含有細菌生物膜抑制活性的樣品過親和整體色譜柱；(5)親和純化洗脫液中細菌生物膜抑制活性的檢測；其中所述受體蛋白為群感系統中與生物膜相關的受體蛋白。所述方法通過檢測QSI活性鑒定生物膜抑制成分，不僅操作簡單、方向明確，而且能有效減少假陽性產物；對天然藥物中抗菌活性成分的分離鑒定有重要意義。

技術領域

本發明屬于天然藥物分離領域，具體涉及一種基于靶蛋白親和整體 色譜柱的細菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法、以及所述分離鑒定方法 中使用的分離裝置。

背景技術

近年研究發現，細菌附著后分泌粘性胞外基質并在其中生長繁殖而形 成的具有高度構造性的復合物，即細菌生物膜(bacterial biofilm，BBF)，是 導致耐藥行為的重要原因。現有抗生素應用不僅不能有效清除BBF，還會 誘導產生耐藥性，因而引起了廣泛的關注。

深入研究發現，BBF的形成等一系列病原菌的生命活動均依賴于群體 感應(quorum sensing，QS)系統的調控。群體感應抑制劑(QS inhibitor， QSI)有別于傳統抗菌藥的作用機制，一方面通過抑制該系統相關受體蛋白 來調控其致病行為(包括BBF形成、外毒素和各種侵襲性酶類的合成和 分泌等)，另一方面并不殺滅細菌從而避免了選擇性壓力導致的耐藥，這為 從根本上解決細菌的抗藥性問題提供了全新的研究思路。

我國中藥和天然藥物資源極其豐富，藥用植物近萬種，為抗菌藥物發 現提供了重要的物質來源基礎。目前已在植物中分離鑒定了一些有效的 QSI，例如從傘形科植物中發現的法卡林二醇，從補骨脂中分離的補骨脂 素，從佛手中發現的佛手苷內酯等。藥用植物源的QSI相此于化學合成抗 菌藥物，具有低毒、廉價、不良反應及副作用相對較小、不易產生耐藥性 等優勢。從天然藥物中發掘靶向群感效應的抗菌藥效物質，不僅具有切實 的可行性，而且有利于經典中藥煥發出新的生命力。

然而，現有從中藥中獲取QSI的策略和方法都同時存在著嚴重的瓶 頸。從篩選策略上看，基于中藥成分復雜多樣的特點，從中獲取QSI一般 必需先經過提取分離鑒別得到單體化合物，然后對每一個單體進行藥效學 篩選驗證。顯然，這種“先分離鑒別，后篩選驗證”的策略不僅耗時，效率 低，而且費用高昂。同時，由于中藥里QSI含量較少，分離純化困難，導 致大部分僅能停留在粗提物上來考察抑制活性。因此，尋找更多高效的 QSI，有效實現對BBF的抑制作用，成為了目前亟待解決的重要科學問題。

現有技術中最新的QSI篩選方法主要集中于以下三類：(1)天然的活 性指示菌分析篩選法，基于QS系統能夠調控細菌某些色素基因的表達， 直觀快速地篩選出QSI，雖然適合大量樣品的粗篩，方法也簡便易行，但 由于樣品有可能對菌體的生長有一定的抑制作用，因而不能排除干擾因素 而導致的假陽性結果。(2)QSI選擇器(QSI Selector，QSIS)篩選法，通過 自殺基因sacB模型進行定性初篩，再利用luxCDABE，lacZ，gfp等模型進 一步量化，從而避免了假陽性結果的出現，已經成功獲得了許多具QSI活 性的合成化合物和天然提取物，但操作復雜，篩選成本高且不適合微量分 析，例如CN105504002A。(3)計算機虛擬篩選法，篩選速度快、成本較 低，有助于提高開發新型藥物的效率；但準確性需要進一步考察，僅適用 于初篩階段。

鑒于現有篩選策略和技術的局限性，嚴重阻礙了中藥QSI的闡明。因 此，尋找其他高效、準確、簡便的篩選方法意義重大。

發明內容

針對上述現有技術中的不足，本發明所要解決的技術問題是提供一種 方法簡單、方向明確、能適應高通量篩選的細菌生物膜抑制成分分離鑒 定方法。

具體而言，本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案如下：

一方面，本發明提供一種細菌生物膜抑制成分的分離鑒定方法，其特 征在于包括以下步驟：