[發明專利]一種表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法

在審

• 申請號: 201710420397.3
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN107345911A
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發明（設計）人: 楚秉泉;朱紅艷;藺磊;何勇
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及魚肉中組胺檢測領域，尤其是涉及一種表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法。

背景技術

生物胺(Biogenic Amine,BA)是一類非揮發性的脂肪族、脂環族或雜環的含氮有機化合物的總稱，其具有一定的生物活性，廣泛存在于生物體及多種食品當中。適量的生物胺在機體內具有重要的生理活性，如調節神經遞質的分泌、控制血壓、參與免疫反應等。但當其攝入過高或在體內大量累積時則可能對機體產生毒性。其中，組胺(Histamine)是毒性最強的生物胺。研究表明，當攝入的魚肉中組胺含量在8～40mg/100g時，便可引發輕微中毒反應，而濃度超過100mg/100g可能會產生嘔吐、頭暈、腹瀉、過敏等嚴重中毒反應，甚至導致休克，危及生命。我國衛生部發布的國家標準《鮮、凍動物性水產品衛生標準》，規定組胺含量：鮐魚≤100mg/100g、其他魚類≤30mg/100g；而歐盟限定魚肉中組胺的平均含量≤10mg/100g。此外，美國FDA還將組胺含量超過50ppm作為評判魚肉變質的標準。因此，準確快速的檢測魚肉中組胺的含量，對保證魚肉品質及消費者的健康安全具有重要意義。

傳統對于魚肉中組胺的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、熒光定量法、離子交換色譜法、毛細管電泳法和酶聯免疫吸附法(ELISA)等，這些方法雖然靈敏度較高，但實驗前處理繁瑣、檢測耗時較長、儀器攜帶不便和試劑價格貴等缺點使之具有一定的局限性。表面增強拉曼光譜(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy,SERS)是一種高靈敏度的指紋圖譜，“表面增強”是指化合物分子吸附到某些納米級粗糙金屬(如金、銀、銅)的表面或溶膠中，其拉曼信號成幾何倍數的增強，因此，SERS技術能實現對微量樣品和單分子的快速檢測。同時，SERS具有前處理方法簡單、儀器攜帶方便且檢測速度快等優點，在農產品殘留農藥的快速篩查、食品中痕量物質的檢測、環境中危害物的檢測等方面應用廣泛。

發明內容

本發明的目的在于采用表面增強拉曼光譜技術(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS)結合密度泛函理論(Density Functional Theory,DFT)，建立準確快速的米魚肉中組胺含量的檢測方法。

本發明所采用的具體技術方案如下：

一種表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法，包括以下步驟：

(1)取米魚肌肉切碎后制成肉泥，稱取若干份等量米魚肌肉作為樣品，并配制不同濃度的組胺標準品溶液加入各樣品中，在儲存過程中取不同時間點的樣品作為加標樣品和預測樣品；

(2)將所述的加標樣品和預測樣品加入三氯乙酸，過濾后得到提取液；

(3)利用HPLC測定預測樣品的米魚肉中組胺的含量；

(4)在加標樣品的提取液中加入納米增強劑后進行拉曼光譜數據采集，并利用密度泛函理論計算組胺對應的拉曼特征峰；

(5)以所述拉曼特征峰的峰強度和組胺的含量建立定量分析模型，并利用該定量分析模型來測量米魚肌肉中組胺濃度。

本發明以石首科新鮮米魚(Miichthys miiuy)肌肉為載體，以額外添加的方式模擬魚肉在儲存過程中組胺的變化，以金納米離子為基底，利用SERS技術結合密度泛函理論(Density Functional Theory,DFT)對魚肉中組胺含量進行定性定量分析。所用米魚背部肌肉切碎，絞肉機制成均勻肉泥，配制不同濃度的組胺標準品溶液，分別添加不同濃度標準液至各樣品中，所使用試驗樣品分加標樣品和預測樣品，制備后用于SERS上機檢測。

作為優選的，所述的組胺標準品溶液包括：用12％三氯乙酸配置組胺濃度分別為0、0.25、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mg/L標準液，以用于制備SERS標準曲線和HPLC標準曲線。所用SERS儀器為RamTracer-200-HS型便攜式拉曼光譜儀聯合785nm激發波長的二極管穩頻激發器。

在步驟(2)中，加標樣品和預測樣品均按1：10的料液比加入三氯乙酸，超聲提取后進行離心分離、過濾，并加入三氯乙酸定容，即得提取液。

作為優選的，在步驟(3)中，利用HPLC測定的步驟包括：

(3.1)除脂：在預測樣品的提取液中加入等體積正己烷，充分震蕩，除去有機相；