[發明專利]一種表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法

在審

• 申請號: 201710420397.3
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN107345911A
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發明（設計）人: 楚秉泉;朱紅艷;藺磊;何勇
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司33224
• 代理人: 胡紅娟

1.一種表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)取米魚肌肉切碎后制成肉泥，稱取若干份等量米魚肌肉作為樣品，并配制不同濃度的組胺標準品溶液加入各樣品中，在儲存過程中取不同時間點的樣品作為加標樣品和預測樣品；

(2)將所述的加標樣品和預測樣品加入三氯乙酸，過濾后得到提取液；

(3)利用HPLC測定預測樣品的米魚肉中組胺的含量；

(4)在加標樣品的提取液中加入納米增強劑后進行拉曼光譜數據采集，并利用密度泛函理論計算組胺對應的拉曼特征峰；

(5)以所述拉曼特征峰的峰強度和組胺的含量建立定量分析模型，并利用該定量分析模型來測量米魚肌肉中組胺濃度。

2.如權利要求1所述的表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法，其特征在于，所述的組胺標準品溶液包括：用12％三氯乙酸配置組胺濃度分別為0、0.25、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mg/L標準液，以用于制備SERS標準曲線和HPLC標準曲線。

3.如權利要求1所述的表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法，其特征在于，在步驟(2)中，加標樣品和預測樣品均按1：10的料液比加入三氯乙酸，超聲提取后進行離心分離、過濾，并加入三氯乙酸定容，即得提取液。

4.如權利要求3所述的表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法，其特征在于，在步驟(3)中，利用HPLC測定的步驟包括：

(3.1)除脂：在預測樣品的提取液中加入等體積正己烷，充分震蕩，除去有機相；

(3.2)萃取：在除脂后液體加入NaCl使溶液飽和，再加入NaOH溶液，混勻后加入正丁醇-氯仿混合溶液，充分振蕩后離心，取上層有機相，萃取后得到萃取液，向萃取液加入鹽酸，混合后于水浴下氮氣吹干，加入鹽酸溶解殘留物，得到待衍生溶液；

(3.3)衍生：向所述的待衍生溶液加入飽和NaHCO₃溶液和丹磺酰氯衍生溶液，烘干后加入飽和NaHCO₃溶液，于40℃水浴下氮氣吹去丙酮，加入乙醚萃取，靜置分層后吸取上清液，將乙醚萃取液通過氮氣吹干后加入甲醇溶解殘留物，再通過濾膜過濾，過濾液用于HPLC檢測；

(3.4)HPLC測定條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18；檢測器：光電二極管陣列檢測器；流動相：A-甲醇，B-超純水；流速：0.3mL/min；檢測波長：254nm；進樣量：5μL；柱溫：30℃。

5.如權利要求1所述的表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法，其特征在于，所述的納米增強劑包括作為基底的銀納米溶膠或金納米溶膠；

金納米溶膠的制備步驟為：將高氯金酸溶液加熱至沸騰后，加入檸檬酸三鈉溶液，同時攪拌，制備成的金溶膠的顏色為酒紅色；待溶液冷卻后，將上述金膠溶液倒入離心管中，離心后倒掉少量上清液，再往離心管中加入超純水，用超聲振蕩混勻，得到金納米溶膠；

銀納米溶膠的制備步驟為：將硝酸銀溶液加熱到沸騰，在2min內逐步滴入濃度為1％的檸檬酸三鈉溶液，同時攪拌，此時溶液由透明變淡棕色，反應后得到的灰綠色液體為銀納米溶膠。

6.如權利要求1所述的表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法，其特征在于，在步驟(4)中，采用DFT中B3LYP雜化泛函，B3LYP為Becke3型參數密度泛函模型對組胺進行理論拉曼光譜計算，根據官能團特征振動頻率可解析組胺的拉曼特征譜峰。

7.如權利要求6所述的表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法，其特征在于，在步驟(4)中，向各樣品依次加入150μL納米增強劑和50mL NaCl，放入配套液體樣品池進行光譜采集。

8.如權利要求7所述的表面增強拉曼光譜定性定量分析米魚肌肉中組胺的方法，其特征在于，對采樣到的表面增強拉曼光譜進行平滑、基線校正處理，去除噪聲和基線漂移，以1262cm^-1處組胺SERS特征峰峰強度與組胺濃度制作的一元線性標準曲線作為定量分析模型，線性方程為y＝27.889x+106.25，相關系數R²＝0.9806。