[發明專利]一種小麥根尖染色體制片的方法

在審

• 申請號: 201710418560.2
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN107246987A
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發明（設計）人: 王海燕;孫昊杰;宋晶晶;宋新穎;張向東;代渴麗;雷佳;王秀娥
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 傅婷婷,徐冬濤

技術領域

本發明屬于植物細胞遺傳學領域，涉及一種小麥根尖染色體制片的方法。

背景技術

國內外育種實踐證明，遺傳基礎狹窄已成為小麥育種難以取得突破的“瓶頸”。為保障小麥安全生產，保障農業生態和環境安全，迫切需要開發和利用新的基因資源、培育綜合抗性好、適應性強的小麥新品種。小麥野生近緣植物長期生活在自然環境中，經受了各種惡劣環境的考驗，具有大量普通小麥不具備或在人工選擇條件下已經喪失的優異基因，如抗病、抗逆、抗蟲、大穗多粒、優質等。通過遠緣雜交方式將小麥近緣物種中的優良基因導入普通小麥創制的新種質，既可以豐富小麥遺傳變異，拓寬小麥的種質資源，而且不涉及轉基因安全性問題，是推進小麥育種取得突破性進展的有效途徑(Friebe等，1996)。在小麥的起源進化研究、外源染色質的鑒定、基因的染色體定位、物理圖譜構建、減數分裂機理等研究中，都涉及到染色體的相關研究。

小麥染色體制片的準備，是開展小麥細胞遺傳學、小麥分子細胞遺傳學以及基于染色體等相關研究的基礎。在小麥染色體制片的準備過程中，預處理是一個非常重要的環節，合理的預處理能得到大量的分裂相和形態好的中期染色體。預處理的機理是抑制微管蛋白組裝成紡錘絲，但并不抑制前期的細胞分裂，因此，凡進入中期的細胞均被阻斷而不能進入后期，積累大量中期分裂相；可誘導染色體進一步縮短變直，便于染色體分散和使染色體形態更清晰。實際操作中常用的方法有物理方法和化學方法。物理方法是用低溫對植物材料進行預處理，處理溫度一般在0～8℃，或用冰水混合物直接對材料進行預處理。此法對染色體無破壞作用，染色體縮短均勻.簡便易行，各種作物都適用，但是并不是任何時候都能獲得較多的中期相。化學方法預處理常用的試劑有：秋水仙素、對二氯苯和8-羥基喹啉。秋水仙素常用濃度0.05-0.2％的水溶液，適用于大、中、小染色體，尤其是適合染色體計數，使染色體易于分散較好，但顯示縊痕較差，而且秋水仙素毒性較強。對二氯苯預處理的效果與秋水仙素相當，也具有較強的毒性；8-羥基喹啉，適宜中、小染色體，離體處理好。優點在于顯示縊痕清晰，缺點在于中期相不如其它多。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種小麥根尖染色體制片的方法。

本發明的目的可通過以下技術方案實現：

一種小麥根尖染色體制片的方法，包含以下步驟：

1)種子發根；

2)預處理：待根長為1.8-3cm時，向培養皿中加入20μmol/LAPM溶液至浸沒根，置于25℃培養箱生長預處理2小時；

3)笑氣處理：將預處理的根尖,在裝有蒸餾水的培養皿中清洗，用剪刀剪根，在室溫條件下，用壓強為1MPa的笑氣處理1-2小時；

4)固定：向用笑氣處理完之后的根加入4℃預冷的90％的冰醋酸，固定5-10min；

5)制片：先取出根尖，在45％醋酸中解離片刻，先切掉根冠，然后切取根尖生長點置于載玻片上，滴一滴45％醋酸解離細胞，蓋上蓋玻片后輕輕敲擊使細胞分散，在酒精燈外焰輕微烘一下后直接壓片。

作為本發明小麥根尖染色體制片方法的優選，步驟1)種子發根的方法為：將種子放置于墊有濕潤濾紙的培養皿中于25℃恒溫箱中發芽，種子露白后，將培養皿中多余的水分倒掉，僅保持濾紙濕潤，移至4℃冰箱中處理20-24h，然后再將培養皿移至25℃培養箱中避光生長至1.8-3.0cm。

作為本發明小麥根尖染色體制片方法的優選，步驟2)中20μmol/L APM溶液的配制方法為：向1000ml蒸餾水中加入100μl的0.2mol/L APM母液，配成20μmol/L的工作液；所述的0.2mol/L APM母液的配制方法為：60.86mg APM溶于10ml預冷的丙酮中,放入-20℃保存。

作為本發明小麥根尖染色體制片方法的優選，步驟3)所述的笑氣處理的方法為：將預處理的根尖,在裝有蒸餾水的培養皿中清洗2次，每次4-5分鐘，用剪刀剪根，將根放入帶孔的eppendorf離心管中，離心管中預先加入適量的去離子水以保持濕潤，在室溫條件下，用壓強為1MPa的笑氣處理1-2小時。

作為本發明小麥根尖染色體制片方法的優選，步驟4)所述的固定的方法為：把用笑氣處理完之后的盛有根的eppendorf離心管置于碎冰上，向離心管中加入4℃預冷的90％的冰醋酸，固定5-10min。

本發明小麥根尖染色體制片的方法進一步優選包含如下步驟：