[發明專利]一種小麥根尖染色體制片的方法

在審

• 申請號: 201710418560.2
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN107246987A
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發明（設計）人: 王海燕;孫昊杰;宋晶晶;宋新穎;張向東;代渴麗;雷佳;王秀娥
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 傅婷婷,徐冬濤

1.一種小麥根尖染色體制片的方法，其特征在于包含以下步驟：

1)種子發根；

2)預處理：待根長為1.8-3cm時，向培養皿中加入20μmol/LAPM溶液至浸沒根，置于25℃培養箱生長預處理2小時；

3)笑氣處理：將預處理的根尖,在裝有蒸餾水的培養皿中清洗，用剪刀剪根，在室溫條件下，用壓強為1MPa的笑氣處理1-2小時；

4)固定：向用笑氣處理完之后的根加入4℃預冷的90％的冰醋酸，固定5-10min；

5)制片：先取出根尖，在45％醋酸中解離片刻，先切掉根冠，然后切取根尖生長點置于載玻片上，滴一滴45％醋酸解離細胞，蓋上蓋玻片后輕輕敲擊使細胞分散，在酒精燈外焰輕微烘一下后直接壓片。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)種子發根的方法為：將種子放置于墊有濕潤濾紙的培養皿中于25℃恒溫箱中發芽，種子露白后，將培養皿中多余的水分倒掉，僅保持濾紙濕潤，移至4℃冰箱中處理20-24h，然后再將培養皿移至25℃培養箱中避光生長至1.8-3cm。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中20μmol/L APM溶液的配制方法為：向1000ml蒸餾水中加入100μl的0.2mol/L APM母液，配成20μmol/L的工作液；所述的0.2mol/L APM母液的配制方法為：60.86mg APM溶于10ml預冷的丙酮中,放入-20℃保存。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)所述的笑氣處理的方法為：將預處理的根尖，在裝有蒸餾水的培養皿中清洗2次，每次4-5分鐘，用剪刀剪根，將根放入帶孔的eppendorf離心管中，離心管中預先加入適量的去離子水以保持濕潤，在室溫條件下，用壓強為1MPa的笑氣處理1-2小時。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟4)所述的固定的方法為：把用笑氣處理完之后的盛有根的eppendorf離心管置于碎冰上，向離心管中加入4℃預冷的90％的冰醋酸，固定5-10min。

6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于包含如下步驟：

1)種子發根：將種子放置于墊有濕潤濾紙的培養皿中于25℃恒溫箱中發芽，種子露白后，將培養皿中多余的水分倒掉，僅保持濾紙濕潤，移至4℃冰箱中處理24h，然后再將培養皿移至25℃培養箱中避光生長；

2)預處理：待根長1.8-3cm時，向培養皿中加入20μmol/L APM溶液至浸沒根，置于25℃培養箱生長預處理2小時；

3)笑氣處理：將預處理的根尖，在裝有蒸餾水的培養皿中清洗2次，每次5分鐘，用剪刀剪根，將根放入帶孔的eppendorf離心管中，離心管中預先加入適量的去離子水以保持濕潤，在室溫條件下，用壓強為1MPa的笑氣處理1-2小時；

4)固定：把用笑氣處理完之后的盛有根的eppendorf離心管置于碎冰上，向離心管中加入4℃預冷的90％的冰醋酸，固定5-10min；

5)制片：先取出根尖，在45％醋酸中解離片刻，用刀片先切掉根冠，然后切取根尖生長點置于載玻片上，滴一滴45％醋酸解離細胞，蓋上蓋玻片后輕輕敲擊使細胞分散，在酒精燈外焰輕微烘一下后直接壓片。