[發明專利]利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法

有效

• 申請號: 201710418337.8
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN107058283B
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 黃青;馬玉涵;何華奇;姚國華
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 合肥市浩智運專利代理事務所(普通合伙) 34124
• 代理人: 王志興

本發明公開了一種利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法，包括如下步驟：(1)靈芝原生質體構建：①靈芝液體培養菌絲體制備；②菌絲體勻漿制備；③細胞壁溶解酶液制備及細胞壁溶解；④原生質體分離及收集；⑤原生質體濃度校正及保存；(2)低溫等離子體誘變原生質體：①原生質體誘變前準備；②等離子體誘變裝置通氣平衡；③反應體系通電，對原生質體進行誘變；④原生質體平板涂布均勻和靜置再生培養；⑤誘變菌株挑選；⑥觀察記錄菌落形態及生長速率，光鏡下觀察菌絲形態；⑦誘變菌株的活性物質和穩定性檢測；⑧保存菌種。本發明的優點在于：提供了一種穩定高效的利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法。

技術領域

本發明涉及農作物誘變育種技術領域，尤其涉及一種利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法。

背景技術

靈芝(Ganoderma Lucidum)為擔子菌亞門、層菌綱、多孔菌目、非褶菌科、靈芝屬的子實體，是比較名貴的傳統中草藥。其中，靈芝的有效成分如靈芝多糖、三萜等具有抗腫瘤、抗氧化、調節免疫，保肝，調節血糖等作用。

靈芝作為多細胞生物，具有較厚的細胞壁，常規的方法很難達到良好的誘變效果；孢子誘變雖然能夠獲得單細胞誘變效果，但其采收季節受到限制。原生質體由于人工去除了細胞壁，受輻射后誘變效率較高，且不受采收季節等限制，在實驗條件下隨時可以進行，是理想的誘變方式。

等離子體被稱為除氣體、液體、固體以外物質的第四態，不同的激發方式和發生器結構可以產生不同熱力學狀態的等離子體。低溫常壓等離子體具有在大氣壓下放電均勻性高、溫度可控在室溫范圍，操作條件安全、溫和，可控性強等特點，適于生物誘變育種，受到了學術界和工業界的廣泛關注。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種穩定高效的利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：一種利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法，包括如下步驟：

(1)靈芝原生質體的構建

①靈芝液體培養菌絲體的制備；

②菌絲體勻漿制備；

③細胞壁溶解酶液的制備及細胞壁溶解；

④原生質體的分離及收集；

⑤原生質體濃度校正及保存；

(2)低溫等離子體誘變原生質體

①原生質體的誘變前準備；

②等離子體誘變裝置通氣平衡；

③反應體系通電，對原生質體進行誘變；

④固體培養基中，原生質體平板涂布均勻和靜置再生培養；

⑤誘變菌株挑選，用牙簽挑選小菌落后，接種于PDA固體培養基上；

⑥觀察記錄菌落形態及生長速率，光鏡下觀察菌絲形態；

⑦誘變菌株的活性物質和穩定性檢測；

⑧選取誘變后品質優良的菌株固體培養，保存菌種。

作為本發明的優選方式之一，所述步驟(1)中靈芝液體培養菌絲體的制備方法為：在無菌條件下，將固體發酵靈芝種子菌絲體接種于滅菌后的PD液體培養基中，于27-29℃，150-200rpm轉速搖床震蕩培養，5-7d后，將菌絲體連同菌液取出，超凈臺中離心后用ddH₂O清洗菌絲體。