[發明專利]利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法

有效

• 申請號: 201710418337.8
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN107058283B
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 黃青;馬玉涵;何華奇;姚國華
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 合肥市浩智運專利代理事務所(普通合伙) 34124
• 代理人: 王志興

1. 一種利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)靈芝原生質體的構建

①靈芝液體培養菌絲體的制備；

②菌絲體勻漿制備；

③細胞壁溶解酶液的制備及細胞壁溶解；

④原生質體的分離及收集；

⑤原生質體濃度校正及保存；

(2)低溫等離子體誘變原生質體

①原生質體的誘變前準備；

②等離子體誘變裝置通氣平衡；

③反應體系通電，對原生質體進行誘變；

④固體培養基中，原生質體平板涂布均勻和靜置再生培養；

⑤誘變菌株挑選，用牙簽挑選小菌落后，接種于PDA固體培養基上；

⑥觀察記錄菌落形態及生長速率，光鏡下觀察菌絲形態；

⑦誘變菌株的活性物質和穩定性檢測；

⑧選取誘變后品質優良的菌株固體培養，保存菌種；

所述步驟(1)中靈芝液體培養菌絲體的制備方法為：在無菌條件下，將固體發酵靈芝種子菌絲體接種于滅菌后的PD液體培養基中，于27-29℃，150-200rpm轉速搖床震蕩培養，5-7d后，將菌絲體連同菌液取出，超凈臺中離心后用ddH₂O清洗菌絲體；

所述步驟(1)中菌絲體勻漿的制備方法為：挑取靈芝菌絲體置于滅菌后的勻漿器中，加入0.6mol/L濃度的甘露醇；勻漿器中研磨，于超凈臺中制備菌絲體勻漿；光鏡下觀察菌絲，2000-5000rpm離心4-6min獲得菌絲體勻漿，保留沉淀；

所述步驟(1)中細胞壁溶解酶液的制備采用復合酶裂解法，為崩潰酶和溶壁酶混合酶裂解液，溶液濃度38-42mg/ml；所述步驟(1)中細胞壁溶解方法為：將菌絲體勻漿沉淀混合溶解于混合酶裂解液中，終濃度10-20mg/ml，30-35℃裂解1-3h；收集裂解液，加壓過濾 法濾去殘余未裂解菌絲，保留過濾裂解液；

所述步驟(2)中等離子體誘變裝置通氣平衡過程為：將介質阻擋反應探棒置于原生質體溶液表面上方，封閉反應體系，通入反應氣體4-6min，氣體流量1.5-2.5L/min；所述步驟(2)中反應體系通電，電壓為10-15kV，誘變3-7min，對原生質體進行誘變處理。

2.根據權利要求1所述的利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法，其特征在于，所述步驟(1)中原生質體的分離及收集方法為：用離心管收集過濾后的細胞壁裂解液，離心后棄去上清，保留沉淀；所述步驟(1)中原生質體濃度校正及保存方法為：利用0.6mol/L甘露醇溶解稀釋原生質體，用血球板計數，光鏡下調整原生質體濃度為1×10⁶-10⁷個/ml，4℃低溫保存，用于后續誘變。

3.根據權利要求1所述的利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法，其特征在于，所述步驟(2)中原生質體的誘變前準備過程為：無菌條件下吸取原生質體溶液200-500μl，置于φ=2cm的石英等離子體反應皿中，輕晃石英等離子體反應皿，使原生質體溶液在石英等離子體反應皿的底部涂布均勻。

4.根據權利要求1所述的利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法，其特征在于，所述步驟(2)中原生質體平板涂布和靜置再生培養方法為：收集原生質體反應溶液，吸取20μl于再生培養基中，用滅菌后的三角涂棒沾取菌液涂布于固體培養基平板上；接著，將涂布完畢后的平板封閉，倒置于25-30℃溫箱靜止培養5-7d。

5.根據權利要求1所述的利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法，其特征在于，所述步驟(2)中誘變菌株挑選方法為：原生質體再生培養5-7d，平板上長出菌落后，選取其中菌落直徑0.5-2mm的單菌落，用滅菌后的牙簽挑取菌絲，接種于PDA固體培養基上；所述步驟(2)中誘變菌株觀察過程為：將挑選分離后的菌落培養5-7d，觀察記錄菌落形態及生長速率，光鏡下觀察菌絲形態。

6.根據權利要求5所述的利用等離子體誘變靈芝原生質體以構建突變菌株的方法，其特征在于，所述步驟(2)中誘變菌株的活性物質檢測過程為：將挑選分離的菌株接種于PD液體培養基中，待菌絲球長滿后對菌絲中活性成分予以測定，與出發菌株活性成分及含量比較，檢測誘變效果并予以記錄；所述步驟(2)中誘變菌株的穩定性檢測過程為：對性狀優良的菌株連續培養3代，進行表觀觀察和活性物質檢測，觀察誘變菌株的穩定性。