[發明專利]一種利用番茄斑萎病毒NSm基因進行抗病基因篩選的方法

有效

• 申請號: 201710415015.8
• 申請日: 2017-06-05
• 公開（公告）號: CN107254477B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 黃昌軍;劉勇;于海芹;童治軍;曾建敏;高玉龍
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/74;C12Q1/18
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;于洪

本發明涉及一種利用番茄斑萎病毒NSm基因進行抗病基因篩選的方法，屬于植物基因克隆技術領域。本發明的NSm基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。通過構建NSm基因的植物表達載體，轉化農桿菌，通過和候選抗病基因共浸潤本氏煙，觀察本氏煙葉片是否產生過敏性壞死的性狀，進而對候選抗病基因進行鑒定。該方法能迅速、高通量的進行抗病基因的鑒定，表明基于該基因開發的植物抗病基因篩選的方法具有十分重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于植物基因克隆技術領域，具體涉及一種利用番茄斑萎病毒NSm基因進行抗病基因篩選的方法。

背景技術

番茄斑萎病毒（Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV）已對煙草、番茄、辣椒、蔬菜等作物生產構成了巨大的威脅。現有的主栽作物品種均能被番茄斑萎病毒侵染，成為番茄斑萎病毒流行、爆發的潛在威脅。由于其傳播介體——薊馬具有發育歷期短、個體小易隱蔽、對殺蟲劑極易產生抗藥性等的特點，所以現有的防治措施難以取得理想的控制效果。利用抗病基因培育抗病作物品種是最經濟、最有效的手段。

以往進行抗病候選基因鑒定和篩選主要利用轉基因過表達結合基因沉默技術進行鑒定。通過分子標記鎖定抗病基因連鎖的scaffolds或基因區段，一般都會有多個候選基因，對多個候選基因分別進行轉基因過表達需要耗費較大的人力物力。因此在進行轉基因過表達前，對候選抗病基因進行進一步的快速準確篩選將極大的減少抗病候選基因鑒定和篩選的工作量，提高準確性。

在經典遺傳學中，基因型控制的植物抗病性常常是由來源于植物的抗病基因 R (resistance)與相應的來源于病原物的無毒基因 Avr (avirulence)互作所決定的，即“基因對基因”學說。Avr基因的克隆和鑒定不僅有助于闡明抗病植株的抗病機制，而且基于Avr基因和R基因的對應關系，更有助于R基因的鑒定和篩選，更迅速的鎖定R基因。因此在R基因克隆前，進行Avr基因的克隆和鑒定，并將含有Avr的表達載體和候選抗病基因一起共浸潤來進行抗病基因鑒定，比起將全部候選抗病基因進行轉基因過表達，并在轉基因植株上來接種病毒來更方便、快捷，可以節約大量的人力、物力和財力。同時利用Avr基因和候選抗病基因一起共浸潤進行抗病基因鑒定具有操作簡便，能減少人為誤差，重復性好，滿足實現大規模檢測的特點。

目前番茄中抗TSWV的基因SW-5b已被克隆，TSWV的NSm為其對應的Avr基因。辣椒中抗TSWV的基因Tsw最近也被已被克隆基因，其對應的Avr基因是TSWV的NSs基因。但是來源于野生煙草N. alata中抗性基因RTSW還未被克隆，其對應的TSWV Avr基因也未見報道。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種利用番茄斑萎病毒NSm基因進行抗病基因篩選的方法，該方法能夠快速地鑒定候選抗病基因，極大的減少了候選基因驗證的難度和工作量，為快速分離、克隆抗病基因奠定了基礎，對煙草抗病育種、抗病基因克隆具有顯著的意義。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種利用番茄斑萎病毒NSm基因進行抗病基因篩選的方法，包括如下步驟：