[發(fā)明專利]一種利用番茄斑萎病毒NSm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710415015.8
• 申請日: 2017-06-05
• 公開（公告）號: CN107254477B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃昌軍;劉勇;于海芹;童治軍;曾建敏;高玉龍
• 申請（專利權(quán)）人: 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/74;C12Q1/18
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;于洪

1.一種利用番茄斑萎病毒NSm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法，其特征在于，包括如下步驟：

鑒定出番茄斑萎病毒基因組中激發(fā)含有抗性位點(diǎn)RTSW的煙草產(chǎn)生抗病反應(yīng)的無毒基因，該無毒基因是NSm基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；

用所述番茄斑萎病毒基因組中的所述無毒基因構(gòu)建含有所述無毒基因NSm的植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌注滲法將構(gòu)建好的含有所述無毒基因NSm的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株中，之后制得帶有所述無毒基因NSm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液；

構(gòu)建含候選抗病基因的植物表達(dá)載體，并將候選抗病基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株中，之后制得帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液；

將帶有所述無毒基因NSm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液和帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液一起注滲到本氏煙葉片脈間，并檢測本氏煙葉片的過敏反應(yīng)；若在本氏煙葉片上檢測到所述過敏反應(yīng)，則表明該候選抗病基因?yàn)樵摕o毒基因的抗病基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法，其特征在于，所述鑒定出番茄斑萎病毒基因組中激發(fā)含有抗性位點(diǎn)RTSW的煙草產(chǎn)生抗病反應(yīng)的無毒基因，具體包括：在所述番茄斑萎病毒基因組中搜索已注釋的病毒功能基因，并從病毒的功能基因中驗(yàn)證出特異針對RTSW抗性位點(diǎn)的無毒基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法，其特征在于，用所述番茄斑萎病毒基因組中的所述無毒基因構(gòu)建含有所述無毒基因NSm的植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌注滲法將構(gòu)建好的含有所述無毒基因NSm的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株中，之后制得帶有所述無毒基因NSm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液，具體包括：

克隆所述無毒基因NSm全長序列，之后將該基因克隆于表達(dá)雙元載體pK2GW7中，構(gòu)建含有所述無毒基因NSm的植物表達(dá)載體；

通過農(nóng)桿菌注滲法將含有所述無毒基因NSm的表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105 菌株中，之后將包含無毒基因NSm的農(nóng)桿菌在根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)基LB中，于28℃培養(yǎng)24小時(shí)，離心收集菌體，再用浸潤緩沖液稀釋成OD600＝0.5的菌體懸液，制得帶有所述無毒基因NSm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法，其特征在于，構(gòu)建含候選抗病基因的植物表達(dá)載體，并將候選抗病基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株中，之后制得帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液，具體包括：

克隆所述候選抗病基因全長序列，之后將其克隆于表達(dá)載體pHellsgate8中，構(gòu)建含有所述候選抗病基因的植物表達(dá)載體；

通過農(nóng)桿菌注滲法將含有所述候選抗病基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中，之后將包含候選抗病基因的農(nóng)桿菌在根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)基LB中，于28℃培養(yǎng)24小時(shí)，離心收集菌體，再用浸潤緩沖液稀釋成OD600＝0.5的菌體懸液，制得帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法，其特征在于，將帶有所述無毒基因NSm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液和帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液一起注滲到本氏煙葉片脈間，具體包括：

將帶有所述無毒基因NSm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液和帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液按照體積比為1：1混合，并控制混合后菌體懸液的OD600＝0.5；

用無菌的去掉針頭的注射器，將菌體懸液9.5-10.5微升，從本氏煙的葉背注滲入葉脈間，形成一個(gè)可見的浸潤斑；將接種后的本氏煙置于20-28℃及80％濕度的環(huán)境中，交替進(jìn)行連續(xù)光照16小時(shí)及連續(xù)黑暗8小時(shí)，共觀察72小時(shí)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法，其特征在于，檢測本氏煙葉片的過敏反應(yīng)，具體包括：

在本氏煙上以含有pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b的EHA105菌株作陽性對照，觀察若本氏煙上產(chǎn)生混合后菌體懸液誘導(dǎo)的過敏反應(yīng)，則表明該候選抗病基因?yàn)樵摕o毒基因的抗病基因。